脊尾白虾3个野生群体遗传多样性的微卫星分析

利用12对微卫星标记分析了莱州湾(LZ)、海州湾(HZ)、象山(XS)脊尾白虾野生群体的遗传多样性.12个位点在3个群体中均表现出高度的多态性.12个微卫星位点共得到115个等位基因,各个位点的等位基因数介于6～14,平均每个位点上的等位基因数为9.583 3个;各个位点的平均期望杂合度(He)、平均观测杂合度(Ho)、平均多态信息含量(PIC)分别为0.8278、0.517 5、0.705 1,表明3个脊尾白虾野生群体均有良好的多态性.经F-统计分析,各个群体间的遗传分化指数均值为0.093 0(0.05＜Fst＜0.15),呈中等水平分化.基于Nei's遗传距离的UPGMA聚类分析显示莱州湾群体与象山群体距离最近,聚为一类,海州群体单独聚为一类.     

脊尾白虾血细胞ESTs的生物信息学与微卫星序列特征分析

对前期测序得到的脊尾白虾血细胞2853条EST序列进行了生物信息学和微卫星序列特征分析。EST序列拼接得到1053条Unigenes,包括329条Contigs和724条Singlets。BLAST分析表明,593(56.3%)条Uingenes与数据库中已知基因具有相似性。KEGG代谢途径分析表明,181条Unigenes映射到120条代谢途径。通过EST-SSR分析,共得到416条微卫星序列,检出率为14.58%。其中,两碱基重复序列374条,占89.90%,AG重复类型最多;三碱基35条,占8.41%,AAT重复类型最多;四碱基7条,占1.68%,AAGT重复类型最多。本研究可为脊尾白虾功能基因资源挖掘及分子标记筛选提供有效数据。     

三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建与群体遗传分析

采用富集文库-菌落原位杂交法分离了30个三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星标记.三疣梭子蟹基因组DNA经HaeⅢ酶切连接后.用固定了((AC)15和(AG)15探针的尼龙膜((Hybond N+)捕捉含有微卫星的片段.转化至大肠杆菌DH5α中.构建三疣梭子蟹微卫星富集文库.菌落原位杂交后.任意选取150个克隆进行测序.阳性克隆率为85.48%.利用软件设计了105对微卫星引物.筛选到稳定扩增标记56对.采用30个三疣梭子蟹个体进行多样性评价.30个位点均表现出多态性.观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量(PIC)的范围分别为0.2222～1.000 0、 0.4367～0.9099和0.350～0.892.本研究筛选的微卫星位点将为下一步三疣梭子蟹遗传多样性分析、家系分析、遗传图谱构建和QTL定位等研究提供基础依据.     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)回交家系遗传变异的微卫星分析

为解析脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)回交家系的遗传变异规律,本研究利用自行开发的25个微卫星标记对本实验室构建的A、B、C3个回交家系的遗传结构特征进行了分析.结果显示,回交家系A、B、C的平均等位基因数(Na)分别为2.21、2.18、2.09,观测杂合度(Ho)分别为0.3805、0.3703、0.2489,期望杂合度(He)分别为0.3629、0.3998、0.2503,多态信息含量(PIC)分别为0.3257、0.3391、0.2585,相较于野生群体与杂交家系已有了大幅度的降低,属中度或低度多态.回交家系A、B、C在25个位点共得到62个等位基因,其中,A家系56个,B家系54个,C家系51个,3个回交家系共同存在的等位基因为39个,6个位点在回交家系中已经纯合(其中,ECL10在A、B、C中都已纯合),计算得出3个回交家系的纯合率分别达到了53.86％、56.53％、63.33％.由此可见,回交家系的基因纯化速率较快,适用于脊尾白虾重要经济性状的遗传解析和优良种质的选育.     

FIASCO法筛选鳜鱼微卫星标记

通过FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)法构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列并对其特征进行分析。鳜鱼基因组DNA经MseⅠ限制性内切酶消化后,选取200~800 bp的片段与MseⅠ接头连接,用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建鳜鱼基因组微卫星富集文库。对其中100个阳性克隆进行测序,60个(60%)含有微卫星序列(GenBank Accession Number:DQ789247~DQ789306)。成功设计了47对鳜鱼微卫星引物,并合成21对引物进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记。结果表明:FIASCO法能有效提高筛选微卫星标记的效率。本研究筛选的微卫星标记可以用于鳜鱼遗传背景分析和遗传连锁图谱构建,并将为鳜鱼基因组结构分析、标记辅助育种以及数量性状位点(QTL)基因的定位等研究提供候选微卫星标记。     

脊尾白虾杆状病毒病研究

脊尾白虾是一种野生的经济虾类，广温，广盐，杂食性，分布面极广，繁殖季节长。我们已在其病虾的肌肉，中肠等组织中发现Ｃ亚群杆状病毒，其形态结构及宿主的细胞病理学特征均与引起中国对虾，长毛对虾，日本对虾等养殖对虾病毒性流行病的Ｃ亚群杆状病毒类同。由此认为，脊尾白虾是我国养殖对虾病毒性流行病病原的常年媒介体。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)近交系3个家系33个微卫星座位的遗传分析

本研究以人工控制条件下采用兄妹交配方式建立的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)近交系为实验材料,利用33个微卫星座位对近交系3个家系进行了遗传检测.统计各家系的等位基因组成,计算等位基因数(N)、杂合度(H)、多态信息含量(PIC)、平均基因纯合率等遗传参数,利用基因频率计算家系间的遗传距离,并进行聚类分析.结果显示,33个微卫星基因座上共检测到72个等位基因,总群体平均N、H、PIC分别为2.758、0.294、0.272;3个家系的平均N、H、PIC分别为2.258、0.226、0.214;2.469、0.283、0.300;2.219、0.268、0.207;可作为3个家系特异标志位点的基因座分别有2个、4个和1个.聚类分析表明,A系和B系先聚为一支,然后与H系聚在一起.研究结果揭示了脊尾白虾3个近交系在33个微卫星基因座上的遗传变异规律,表明近交家系已达到一定的近交程度;发现各家系潜在的标志基因座,各家系均已构成独立遗传群体.     

青石斑鱼微卫星标记的筛选及群体多态性分析

微卫星DNA,又称短串联重复序列(STR)或简单序列重复(SSR),是广泛存在于真核生物基因组中的简单重复DNA片段,一般每个重复单位仅1～6个碱基,重复数为10～20次,其中动物体中以双核苷酸(CA/GT)n最为常见。根据微卫星DNA核心序列两端的保守序列设计引物     

日本蟳微卫星富集文库的建立与多态性标记的筛选

采用磁珠富集法筛选日本蟳微卫星分子标记。日本蟳基因组DNA经Sau3 AⅠ酶切后,收集400~1 200 bp大小的片段并纯化,利用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)¹⁵从中筛选出含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的基因组文库,经PCR检测筛选出阳性克隆进行测序。从随机挑选的970个菌落中筛选出369个阳性克隆进行测序,结果86.99%(321个)含有微卫星序列,其中完美型占80.54%,非完美型占15.95%,混合型占4.28%。除使用的探针AC重复外,还得到GA、CT等重复序列。共设计出102对微卫星引物,其中65对能扩增出清晰条带,27对具有多态性。同时筛选出的微卫星标记可为今后研究日本蟳的分子遗传育种提供有效的遗传标记。     

脊尾白虾家系育苗试验

采用天然纳苗获得的脊尾白虾,经人工强化培育后挑选健康强壮的个体作为亲本,进行家系配对人工育苗.试验设9组,亲虾抱卵孵化后采用小水体培育幼体,幼体初期投喂螺旋藻粉.平均育成率达到67.49%,最高育成率达到73.91%.     

实用WSSV定量检测方法的建立及其应用于脊尾白虾病毒感染规律的研究

为优化当前白斑综合征病毒( WSSV)定量检测方法,实验结合当前WSSV诊断与定量方法应用的实际,试图通过设计两对普通PCR引物来建立一种实用的WSSV绝对定量方法,并利用此方法进一步探明WSSV在脊尾白虾体内的增殖规律及致病性.首先根据WSSV的囊膜蛋白VP28基因序列设计了两对特异引物(F1,R1)和(RF2,RR2),分别用于标准品质粒的构建和扩增子的扩增,以开展SYBR Green染料法定量检测WSSV的研究;随后利用该定量检测方法分析了WSSV在脊尾白虾体内的组织分布及感染规律.研究结果显示:(1)以定量引物RF2和RR2建立的SYBR Green绝对定量检测方法具有敏感度高、特异性强、定量范围广且准确等特点;(2)WSSV能感染脊尾白虾鳃、肝胰腺、肌肉、头胸甲下结缔组织、胃及肠等组织,其中头胸甲下结缔组织病毒含量最高(1.1×107 copies/μg),其次是鳃组织(4.1×106copies/μg);正常脊尾白虾感染WSSV,首先经过一个约48 h潜伏期,而后开始大量增殖并造成部分虾死亡,死亡率约为20％.     

超低温冷冻对脊尾白虾精子几种酶活性的影响

研究了超低温冷冻保存(-196℃)对脊尾白虾精子内琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、Na+/K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)与顶体酶活性的影响,以期为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论依据.设置对照组(未添加抗冻剂)、3个实验组[分别添加DMSO (V/V) 10.0％、12.5％、15.0％],于冷冻0、1、3、5、7、15d取样测定各酶活性.结果表明,经冷冻后,除GR外,其他所测酶活性均出现显著下降(P＜0.05),且以对照组酶活性下降幅度最大.GR活性在冷冻7d内显著升高,且对照组明显高于实验组(P＜0.05),在冷冻15d时又出现下降.添加15.0％ DMSO组所测酶活性均高于同期其它各组,表明15.0％ DMSO对精子内酶的保护作用较好.冷冻15 d后15.0％ DMSO组的SDH、LDH和Na+/K+-ATP酶活性由(28.500±1.453) U/mL、(1290.836±27.603) U/L和(2.605-0.232) μmol/(mg·h)分别降至(15.300±0.950) U/mL、(363.713-13.943) U/L和(0.542-0.186) μmol/(mg.h);SOD和CAT活性由(106.497±7.217) U/mL、(383.632±4.731)U/g分别降至(17.036 ±0.321)U/mL、(166.940±1.910) U/g;顶体酶活性从(3.521±0.010)μIU/106降至(1.212±0.043)μIU/106;而GR活性由(217.042±6.962) U/L上升至(302.787±24.558)U/L.从冷冻后各酶下降幅度来看,超低温冷冻对SOD活性的影响最大,其次是Na+/K+-ATP酶.     

脊尾白虾热休克蛋白HSP70基因的克隆及其表达分析

克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5′端)和208 bp(3′端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮胁迫都可以引起该基因的高表达,而且肝胰腺中的高表达时间相对肌肉中出现的较早。试验结果表明,温度、pH和氨氮胁迫对脊尾白虾HSP70基因表达有一定的诱导效果,但胁迫的时间过长则抑制其表达,肝胰腺对胁迫比肌肉较敏感。     

脊尾白虾“僵尸病”的初探

为确定2018年冬季以来江苏省沿海地区养殖脊尾白虾患“僵尸病”的病原及流行病学特点，实验采用LB培养基和PDA培养基从病虾血淋巴中分离得到直径为1~3 mm、边缘整齐、米黄色隆起菌落；人工回感实验结果显示，回感后的脊尾白虾表现出与自然患病脊尾白虾相同的症状，并在回感脊尾白虾体内也分离出了相同的菌株，符合科赫氏法则。对该菌株进行形态观察结合18S rRNA序列对比及系统发育分析，发现分离菌株MQ2101具有酵母的典型形态，且与二尖梅奇酵母相似度达99.82%，结果表明菌株MQ2101为二尖梅奇酵母。致病性结果初步分析显示，MQ2101对脊尾白虾的半致死浓度 (LD₅₀)为1.39×10⁷ CFU/尾。病理学观察发现，患病脊尾白虾鳃、肌肉和肝胰腺均发生不同程度的病变，其中肝胰腺病变最为严重，肝小管呈现空泡化，管腔体积变大；在鳃和肝胰腺组织中均存在大量定殖的菌体。流行病学调查结果显示，每年2—5月发病迅速，发病率为5%~30%，死亡率为3%~10%。本研究确定了二尖梅奇酵母为江苏沿海地区脊尾白虾“僵尸病”的病原，其对脊尾白虾具有较强致病性，主要侵染组织为肝胰腺和鳃。以上研究结果为脊尾白虾“僵尸病”的防控提供了相关科学依据。     

脊尾白虾3个野生群体ITS1序列分析及其亲缘关系分析

对脊尾白虾的莱州湾、海洲湾、象山湾3个野生群体共计62个个体的核糖体RNA转录单元内间隔区ITS1基因片段进行克隆和测序,对序列特点进行分析,并结合GenBank数据库中已有的长臂虾亚科ITS1同源序列虾类进行系统分析。结果显示,脊尾白虾的ITS1序列具有长度多态性,其长度为345~384 bp,62条序列GC的平均含量显著高于AT含量;共检测到79个变异位点,39种单倍型,多态位点比例为21.7%;海洲湾群体遗传多样性指数最高,象山湾群体次之,莱州湾群体最低。在脊尾白虾ITS1序列中发现微卫星序列共有8处,重复序列类型为(GC)n、(AG)n、(GGC)n、(GGA)n、(AT)n、(GA)n,以(GA)n类型最多。AMOVA分析结果显示3个群体间的遗传分化较弱或只有中度分化。另外用MEGA4.0软件中的NJ法构建分子进化树,探讨长臂虾亚科几个种的系统进化关系,系统树显示同种的不同个体、同属的不同种聚在一起,与形态学的分类吻合。     

脊尾白虾的性腺发育及组织结构观察

为系统研究脊尾白虾的性腺发育及组织学特征,采用常规的石蜡切片及H.E染色方法对脊尾白虾的性腺发育及其组织结构进行观察。结果表明,脊尾白虾的雌性生殖系统由卵巢、输卵管及排卵孔组成。卵子发生经历了卵原细胞、卵黄合成前期卵母细胞、内源性卵黄合成期卵母细胞、外源性卵黄合成期卵母细胞,最后发育为成熟的卵母细胞。卵巢发育可分为增殖期、小生长期、大生长期、成熟期及产后恢复期。脊尾白虾雄性生殖系统由精巢、输精管及排精孔组成。精巢由生精小管构成,不同生精小管内精子发育可不同步。精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞,最后发育为精子。输精管可分为前、中、后输精管及末端壶腹,精荚在输精管中形成。     

富集文库－菌落原位杂交法筛选栉孔扇贝的微卫星标记

应用微卫星富集文库─菌落原位杂交法,筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记.用固定了(AG)15和(AC)15探针的尼龙膜(Hybond N )捕捉含有微卫星DNA的片段,经洗脱、PCR扩增和TA克隆,构建栉孔扇贝的微卫星富集文库.利用ECL试剂盒(Amersham公司)标记的(AG)15和(AC)15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库,阳性克隆经测序获得微卫星DNA.富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后,532个(44.3%)为阳性克隆.任意挑选100个克隆测序,结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点.利用软件设计了65对特异性PCR引物,40对能扩增出清晰的带谱;利用48个栉孔扇贝个体评价微卫星位点,分析表明37个位点具有多态性.不同的位点获得的等位基因数目为2～14个不等,37个多态性位点共获得258个等位基因,平均每个位点获得7.0个等位基因.观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量值(PIC)的范围分别为0.1000～1.0000、0.1197～0.9831和0.1172～0.9782.结果表明,富集文库─菌落原位杂交法适合大规模筛选目标物种的微卫星标记.     

脊尾白虾线粒体基因组应答饥饿的甲基化特征分析

为研究脊尾白虾应答饥饿的线粒体基因组表观遗传学特征,本研究在筛选适宜脊尾白虾线粒体基因组甲基化位点分析的BSP引物基础上,对不同饥饿期该虾线粒体基因组的甲基化特征进行了分析。共设计覆盖脊尾白虾线粒体全基因组序列的BSP引物51对,经验证其中10对引物可用于脊尾白虾线粒体基因组的甲基化特征分析,选用其中具有稳定扩增产物的5对引物分别对饥饿10、20和30 d的脊尾白虾线粒体基因组的甲基化特征进行了分析,结果表明,脊尾白虾耐受饥饿的平均死亡时间为19.8 d,最长耐受时间为48 d,在不同饥饿阶段线粒体基因组均可发生甲基化现象,且在第10天时甲基化比例最高,而第20和30天时甲基化比例反而降低;甲基化主要发生在ND基因位点上,据此推测这种甲基化可能用来调节能量代谢相关的电子传递链过程。本研究首次揭示了脊尾白虾线粒体基因组存在甲基化现象,为展开虾类线粒体基因组表观遗传学研究奠定了理论基础。     

脊尾白虾EcR基因的克隆及其在卵巢和胚胎发育过程中的表达分析

为了解蜕皮激素受体(EcR)在脊尾白虾卵巢和胚胎发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾EcR基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC506600),用实时荧光定量PCR方法分析了EcR基因在雌虾不同组织、卵巢以及胚胎发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾EcR基因全长2 638 bp,开放阅读框1 713 bp,编码570个氨基酸,脊尾白虾EcR在系统进化上与行抱卵繁殖的真虾类和蟹类亲缘关系较近,而与对虾类较远。脊尾白虾EcR基因在各组织中均有表达,但主要在肝胰腺内表达。在脊尾白虾繁殖期内,肝胰腺内EcR的表达量始终高于卵巢,表达量峰值出现在卵巢成熟时期,而卵巢内EcR的表达量在卵巢成熟前期达到最大,两种组织中EcR表达量与卵黄蛋白原(Vg)质量浓度变化趋势相一致。随着胚胎发育,EcR表达量呈先上升后下降趋势,在原肠期达到最大,前溞状幼体期和溞状幼体Ⅰ期的表达量虽有下降,但仍保持较高水平。结果表明,脊尾白虾EcR基因系统进化方向与虾蟹类不同繁殖方式相吻合,其mRNA主要在肝胰腺内表达;卵巢发育过程中,EcR基因参与了肝胰腺和卵巢中Vg合成,其在肝胰腺中表达量变化与性腺发育指数变化趋势一致,对卵巢成熟有重要作用;在胚胎发育过程中,EcR基因参与了胚胎细胞分化及器官形成。