通过HRM技术筛查与梨矮生性状决定位点PcDw紧密连锁的SNP标记

在果树的基因组中存在大量的SNP（single nucleotide polymorphism）位点,筛查与目标性状紧密连锁的SNP标记,对目标基因的精细定位具有重要意义。以‘矮生梨’（Pyrus communis L.‘Aishengli’）与‘茌梨’（Pyrus bretschneideri Rehd.‘Chili’）的F1杂交分离群体共215个单株为试材,参考苹果基因组的序列设计26对适合HRM分析的引物,依据分离群体分组分析（bulked segregant analysis,BSA）原理,通过高通量熔解曲线（high resolution melting,HRM）分析,筛选到两个与决定梨矮生性状的PcDw基因连锁的标记CNqau012和CNqau039,二者与目标位点的连锁距离分别是13.3 cM和2.3 cM。对CNqau012和CNqau039的扩增子测序分析表明,在矮生型与普通型中都存在一处单核苷酸变化（分别是G/A和C/T）。这些标记的获得对PcDw基因的精细定位及克隆具有重要意义。     

应用InDel标记进行软枣猕猴桃杂交子代真实性鉴定

【目的】对杂交后代进行真实性鉴定是进行猕猴桃分子遗传学研究的前提。通过筛选InDel引物对软枣猕猴桃2个杂交后代群体进行InDel标记研究,以鉴定杂种后代的真实性。【方法】采用高通量磁珠法提取软枣猕猴桃‘永丰1号’(♀)、‘RB-3’(♀)、‘11-17’(♂)、‘魁绿雄’(♂)亲本基因组DNA,以及‘RB-3’ב魁绿雄’子代175株和‘永丰1号’ב11-17’子代531株的基因组DNA;根据重测序数据设计InDel引物,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳在4个亲本中进行多态性验证,选择扩增带型清晰、稳定以及在父本中出现特异性条带的引物用于杂种子代鉴定,根据所选引物中InDel片段长度选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳,对‘RB-3’ב魁绿雄’和‘永丰1号’ב11-17’2个杂交F1代群体进行真实性鉴定。【结果】在‘RB-3’ב魁绿雄’的杂交组合中,共筛选出4对引物,作为杂种鉴定的标记,鉴定杂交后代的真杂种比率为92.00%。在‘永丰1号’ב11-17’杂交组合中,同样筛选到4对,杂交后代的真杂种比率为99.24%。【结论】InDel标记可有效地对猕猴桃杂交后代进行真实性鉴定,真杂种的鉴定为后续的分子标记辅助育种、遗传图谱构建等奠定基础。     

基于EST的猕猴桃SSR标记的建立

利用NCBI公共数据库最新公布的猕猴桃EST(Expressed Sequence Tag)序列,开发猕猴桃的SSR(Simple Se-quence Repeats)标记。对来源于猕猴桃(Actinidia spp.)非冗余EST数据库(NCBI dbEST)的56400条基因序列使用SSRHunter1.3软件进行了SSR筛查,从中共获得了7939条SSR。应用Primer5.0软件设计合成了85对猕猴桃EST-SSR引物,从中筛选出可进行荧光标记的6对引物:Ad01、Ad02、Ad03、Ad09、Ad42、Ad72。利用该6对EST-SSR荧光标记引物在DNA测序仪上对猕猴桃种质的多态性进行了PCR检测,结果表明均能清晰地产生多态性分离。研究结果表明,通过猕猴桃EST数据库的发掘能够有效地筛选到基因水平的SSR标记。     

与黄瓜矮生基因连锁的ISSR标记及其SCAR转换

以黄瓜矮生品系D8与蔓生品系JIN5杂交并自交得到的124株F₂代为试材,应用ISSR分子标记技术和BSA（混合群体分组分析法）法寻找与黄瓜矮生基因连锁的分子标记。从80条ISSR引物中筛选到一个黄瓜矮生性状特异的多态性引物UBC818,经F₂代单株验证,UBC818的扩增片段在蔓生黄瓜JIN5植株中稳定出现,而在矮生黄瓜D8植株中没有。连锁关系分析表明,标记与黄瓜矮生基因间的遗传距离为11.1 cM。根据对该片段的序列分析结果重新设计了1对引物,将ISSR标记成功转化成了SCAR标记, 并命名为UBC818-S。     

SSR标记鉴定甜瓜品种‘红月亮’种子纯度

为明确甜瓜品种‘红月亮’F1代的种子纯度,通过提取甜瓜‘红月亮’子叶DNA,利用SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记对甜瓜品种红月亮F1代种子DNA进行了PCR扩增、检测与分析。结果表明,在20个SSR引物组合对亲本及F1代筛选中,共有6对引物组合具有多态性,多态率30%。选择CMBR026用于‘红月亮’F1代种子纯度鉴定,使用该标记共检测118株,其中2株为自交株,种子纯度为98.3%;试验用的‘红月亮’种子田间鉴定纯度为99.5%,鉴定结果一致。SSR分子标记方法更能准确鉴别出‘红月亮’中的不纯株,且大大缩短纯度鉴定周期。     

桃果实有毛/无毛性状的SCAR标记

 以桃品种‘京玉’和‘美味’的正反交69株F1 群体为试材, 利用RAPD技术扩增出了与桃果实有毛/无毛性状(G/ g) 连锁的2 258 bp的多态性片段, 经克隆、测序后, 根据获得的序列重新设计了两对引物进行SCAR转化。引物对BFP94 /BFP95在有毛和无毛个体中均扩增出了2 258 bp的片段, RAPD显示的多态性消失。利用引物对BFP96 /BFP98成功将RAPD标记转化成了SCAR标记, 并命名为SCP2022258。该标记仅在果实有毛的个体中出现, 与有毛/无毛性状的连锁距离为718 cM, 且扩增稳定, 为桃果实有毛/无毛性状育种的分子标记辅助选择奠定了基础。     

香菇135菌株特异SCAR标记的分布和遗传特性

用香菇（Lentinula edodes）135菌株的特异SCAR（Sequence Characterized Amplified Region）引物135F／R（扩增601bp的条带）对135菌株的58个原生质体单核体和97个孢子单核体的基因组DNA进行扩增，检验此特异标记在单核体中的分布和遗传规律。原生质体单核体分为两种交配型A1B1和A282，此标记仅存在于后一种核中；另外，此标记在四种交配型的孢子单核体后代中随机分布，显示这个SCAR标记可以稳定遗传到后代，而且与交配型A、B因子之间没有连锁关系。     

辣椒抗根结线虫基因Me3的精细定位

 以含Me3基因的抗根结线虫辣椒自交系‘HDA149’为父本,感根结线虫辣椒自交系‘8214’为母本,构建了一个2 133株的F2作图群体。采用群体分离分析法（Bulked Segregant Analysis,BSA）,构建抗、感病两个DNA池,对由两亲本筛选出来的285对引物进行扩增分析,发现引物SSCP_B322和EPMS658在抗、感池间具有稳定的多态性。继续用这两对引物对F2单株进行扩增,以JoinMap 3.0软件分析发现SSCP_B322和EPMS658标记位于Me3基因两侧,遗传图距分别为0.56 cM和1.33 cM。运用回交群体BC1和F3群体验证实了这两个标记,可有效用于辣椒抗线虫分子标记辅助育种,也为图位克隆Me3基因奠定了基础。     

不同猕猴桃品种果实发育过程中总酚和类黄酮含量及抗氧化活性的动态变化

【目的】探讨不同猕猴桃品种果实发育过程中总酚、类黄酮含量及抗氧化活性的动态变化差异。【方法】以江西主栽的美味猕猴桃'金魁’和中华猕猴桃'红阳’以及本课题组自主选育的毛花猕猴桃'赣猕6号’为试材,对果实生长发育过程中总酚、类黄酮含量和FRAP抗氧化能力、清除羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)和超氧阴离子自由基(·O2-)的能力进行检测分析。【结果】3个猕猴桃品种果实总酚和类黄酮含量在果实生长发育过程中大体呈现由高到低的变化趋势;但不同品种其含量差异显著,尤其'赣猕6号’总酚含量高于其他两个品种十几倍。对抗氧化活性检测发现',赣猕6号’比其他两个品种具有较强的FRAP抗氧化能力和清除超氧阴离子自由基(·O2-)能力。相关性分析显示',赣猕6号’清除·OH和·O2-能力与总酚、类黄酮含量存在极显著或显著相关性',金魁’FRAP抗氧化能力与总酚、类黄酮含量存在极显著和显著相关性,而'红阳’FRAP抗氧化能力、清除DPPH·能力分别与总酚、类黄酮含量存在显著和极显著相关性。【结论】猕猴桃果实含有丰富的酚类物质,随着果实的生长发育呈现逐渐降低的趋势。猕猴桃抗氧化能力与总酚、类黄酮含量呈显著正相关。毛花猕猴桃'赣猕6号’比美味猕猴桃'金魁’和中华猕猴桃'红阳’具有更高含量的酚类物质和更强的抗氧化能力。本试验为猕猴桃优良品种的推广、野生资源发掘、新品种选育、天然抗氧化保健药物以及功能性食品的开发奠定了基础。     

桃果实非酸/酸性状SCAR标记的转化与验证

 根据筛选到的与桃果实非酸/酸性状紧密连锁的3个AFLP标记特异片段序列信息, 设计特异引物BFPA1/A2、BFPB1/B2和BFPC1/C2。3个特异引物在‘京玉’桃、‘美味’油桃及其正反交F¹代69株群体中的PCR检测结果表明: 引物BFPB1/B2在果实性状表现为酸的后代个体中扩增出分子量大小为158 bp的特异条带, 且根据特异片段AT-CTA₁₉₉不同部位设计的引物都能稳定扩增, 只是片段大小有所差异;特异扩增检测F¹群体分离结果与原先AFLP_AT/CTA标记完全一致, 表明AFLP标记已成功转化为SCAR标记,该SCAR BFPB1/B2标记与D基因的连锁距离为2199 cM。利用SCAR BFPB1/B2标记对‘大久保’桃ב兴津’油桃的F²群体60株个体的果实非酸/酸性状进行检测, 基因型与表型性状符合率为96.7% , 并且表现为共显性标记。特异引物BFPA1/A2和BFPC1/C2的扩增多态性条带在亲本及后代中消失。     

基于EST-SSR标记分析猕猴桃种质遗传关系

利用开发的11对EST-SSR引物分析了33份猕猴桃种质资源的遗传多样性及其遗传关系。结果表明,11对EST-SSR引物在所有供试材料中均可扩增出清晰条带,其中有8对引物呈现多态性,多态性扩增率为72.7%,对33份种质材料的区分率达100%。8对多态性引物共检测到61个等位基因,每对引物可检测到的等位基因数为2-17,平均为7.6个。利用NTSYS-pc软件,以不加权成对算术平均法(UPGMA)对扩增结果进行聚类,谱系图显示,33份种质材料之间的相似系数在0.60～0.97,表明猕猴桃种质之间遗传关系相对来说不是很远。在相似系数0.73的水平上可将供试猕猴桃材料分为7个类群,其结果与传统的形态分类大体一致。从分子角度揭示了猕猴桃种质资源的遗传多态性及其遗传关系。可为猕猴桃种质改良提供理论依据。EST-SSR是非常有效和可靠的分子标记,可为猕猴桃分子育种及遗传连锁图构建奠定基础。     

一氧化氮对猕猴桃果实营养品质和活性氧代谢的影响

分别用10、20和30μL.L-1一氧化氮(NO)气体熏蒸猕猴桃果实,研究NO对采后徐香猕猴桃(Actinidia chi-nensis Planch.cv.Xuxiang)的营养品质变化和活性氧代谢的影响。结果表明,20μL.L-1 NO处理后的猕猴桃果实含有较低的可溶性固形物和较高的可滴定酸、维生素C,且果实中丙二醛和超氧自由基质量分数低于其他体积分数的NO熏蒸处理(10和30μL.L-1 NO)。20μL.L-1 NO处理降低了猕猴桃果实中LOX活性,延缓了猕猴桃果实采后期间CAT活性的降低,显著提高了猕猴桃果实SOD和POD活性,且显著降低了猕猴桃果实中过氧化氢的质量分数。20μL.L-1 NO气体熏蒸保持了猕猴桃中较高的叶绿素、类胡萝卜素以及维生素E的质量分数。     

中华猕猴桃雄性新品种‘磨山4号’

 ‘磨山4号’是从野生中华猕猴桃中选育出的雄性新品种, 花期比其它雄株长10 d左右, 可与所有中华猕猴桃及开花早的美味猕猴桃品种花期相遇。株形紧凑, 宜密植, 有效花粉量高, 用它作授粉树可增加果实单果质量及维生素C含量。     

红肉猕猴桃种质资源果实性状及AFLP 遗传多样性分析

 对中国红肉猕猴桃种质资源进行收集和调查,并对其进行果实性状变异分析和AFLP 遗传多 样性及遗传关系分析。结果表明,红肉猕猴桃野生资源主要分布于湖南省、湖北省、河南省、江西省、 四川省和陕西省等地,共采集到52 份野生资源和2 份品种资源（包括软枣猕猴桃红肉类型、中华猕猴桃 红肉类型和美味猕猴桃红肉类型）。红肉猕猴桃种质资源在果实性状和DNA 分子水平上都存在丰富的变 异和较高的遗传多样性水平,4 对AFLP 引物共扩增出259 个多态性位点,多态性位点百分率为90.56%, Nei’s 基因多样性和Shannon’s 信息指数分别为0.318 和0.477;资源间遗传相似性系数介于0.568 ~ 0.883 之间,平均为0.714。聚类分析和主坐标分析将54 份资源划分为4 个组,软枣猕猴桃红肉类型单独聚为 一类;中华猕猴桃和美味猕猴桃红肉类型亲缘关系较近且有按地理来源优先聚类的趋势。果实性状数据 和AFLP 数据之间具有极显著的相关性,二者可结合用于红肉猕猴桃资源评价和保护利用工作中。     

桃果实白肉/黄肉性状的RAPD标记向SCAR标记的转化研究

以桃品种京玉和美味的正反交69株F1群体为试材,利用RAPD技术扩增出了与桃果实白肉/黄肉性状连锁的899bp的多态性片段,经克隆、测序后,根据获得的序列重新设计了一对引物进行SCAR转化。利用引物对BFP15/60成功将RAPD标记转化成了SCAR标记,并命名为SCU03-900。该标记仅在果肉为白肉的个体和重组型个体中出现,与白肉/黄肉性状的连锁距离为21cM,且扩增稳定,为桃果实白肉/黄肉性状育种的分子标记辅助选择奠定了基础。     

猕猴桃SRAP-PCR体系的建立及品种资源亲缘关系研究

以猕猴桃属（Actinidia Lindl.）不同种幼嫩叶片为材料,建立了基因组DNA提取的改良SDS法,在此基础上采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,建立了适合猕猴桃SRAP分析的优化体系,即在20 μL总的反应体系中包括：DNA（40 ng ? μL-1）1 μL、Taq DNA酶（5 U ? μL-1）0.2 μL、dNTPs（2.5 mmol ? L-1) 1.4 μL、引物（10 μmol ? L-1）各1.5 μL、Mg2+（25 mmol ? L-1）2.0 μL、10× 缓冲液2.5 μL、ddH2O 9.9 μL。利用该体系对32份猕猴桃品种资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,结果表明14条引物共扩增出275个多态性位点,多态性百分率为100%,SRAP可以作为猕猴桃资源亲缘关系研究的有效标记;在遗传相似系数0.73水平处,供试材料可区分为4组,分别是中华猕猴桃、美味猕猴桃、黑蕊猕猴桃和毛花猕猴桃组。聚类结果表明中华猕猴桃与美味猕猴桃有着非常近的亲缘关系,毛花猕猴桃与中华猕猴桃之间的亲缘关系较远,黑蕊猕猴桃与美味猕猴桃之间亲缘关系可能较近。     

夏季遮阴对猕猴桃园生态因子和光合作用的影响

以中华猕猴桃翠玉和美味猕猴桃米良一号为试材,研究高温季节(7月初-9月底)不同遮阴强度(0、25%、50%、75%)对猕猴桃园生态因子和光合作用的影响。结果表明:未遮阴的自然条件下,猕猴桃叶、果表面温度极高,蒸腾强烈,叶片光合作用出现严重的"午休"现象,表明树体处于严重的胁迫状态;遮阴可在一定程度上降温增湿,改善猕猴桃冠幕微环境,大大降低叶温和果温,有效消除叶片光合作用的"午休"现象。翠玉适宜的遮阴强度约为25%,米良一号约为50%。遮阴对翠玉叶片蒸腾速率无显著影响,但对米良一号的影响较大。可见,适度遮阴能有效缓解夏季高温强光对猕猴桃的危害,但过度遮阴有负面影响。     

野生毛花猕猴桃果实表型性状及SSR遗传多样性分析

以江西省武功山境内的70份野生毛花猕猴桃种质资源为试材,对其果实表型性状、SSR遗传多样性及其亲缘关系进行分析和评价。根据UPOV（国际植物新品种保护联盟）公布的猕猴桃属品种测定标准对供试材料的果实表型性状进行观测。参照猕猴桃遗传连锁图谱,选用分布于中华猕猴桃基因组中的70对SSR引物对供试材料进行多态性分析。结果表明,在70对引物中,21对引物成功扩增出多态性片段。随机采集的70份野生毛花猕猴桃种质资源中,其果实表型性状和DNA分子水平均存在丰富的遗传多样性。基于UPGMA聚类分析将供试的野生毛花猕猴桃资源分为果实圆形和椭圆形混合组、果实椭圆形组以及果实圆柱形组。21对多态性高的SSR引物共检测出127个等位变异位点,变异范围在2 ~ 12之间,平均每对SSR引物可检测到6.04个等位位点。遗传相似系数（GS）变异范围为0.5306 ~ 0.9252。GS值在0.65水平上UPGMA聚类分析可将供试的野生毛花猕猴桃种质资源划分成Ⅰ、Ⅱ和 Ⅲ 共3个组,这与果实表型性状分析的结果基本一致。这些遗传变异丰富的种质资源可为猕猴桃育种提供有价值的材料。     

用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立

 为了有效和全面鉴定白菜和大白菜品种, 研制了由3个引物对组成的6套EST-SSR复合标记 组合, 并形成了多重SSR的最佳实用试验条件。经由这6套标记组合完全鉴别了43个白菜和大白菜品种差异的检测, 并在3个大白菜杂交种个体之间的表现一致, 比较了单引物标记与复合标记的鉴定效率, 验证了这套技术和组合可以表达白菜和大白菜品种间多态性、品种内一致性及稳定性和重复性, 确认其可以高效准确和全面地鉴别白菜和大白菜品种的真实性和杂交种纯度。