大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆、表达和酶学活性分析

利用RT-PCR技术,从大豆叶片总RNA中扩增了乙醇酸氧化酶(GO)基因的cDNA序列,克隆到pMD19-T simple上,进行测序,然后将乙醇酸氧化酶的cDNA克隆至原核表达载体pRSET-A上,转化E.coli BL21,并对该基因在E.coli中的表达进行了研究。     

猪囊尾蚴TsCL-1基因的原核表达

【目的】探讨原核表达猪囊尾蚴TsCL-1蛋白的生物学特性,为研究半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)在猪囊尾蚴与宿主相互关系中的作用奠定基础。【方法】将含有猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的pGEX-4T-TsCL-1重组质粒转入大肠杆菌BL21进行表达,诱导后的重组菌裂解上清通过谷胱甘肽(GST)-琼脂糖亲和层析法进行纯化,纯化产物利用明胶蛋白电泳法进行活性检测。【结果】经SDS-PAGE分析显示,猪囊尾蚴TsCL-1基因表达的重组蛋白相对分子质量约为61ku,表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的57.4%。表达产物应用GST琼脂糖凝胶纯化后,纯化蛋白的纯度可达90%以上。明胶蛋白电泳结果显示,纯化蛋白对明胶具有水解活性,并且其水解活性能被半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E-64抑制。【结论】从重组菌中成功表达了目的蛋白,该蛋白具有明显的水解活性,且E-64对其水解活性有抑制作用。     

猪囊尾蚴API基因原核表达条件的优化

【目的】获得猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂(API)基因在大肠杆菌中的最佳表达条件,为API功能研究奠定基础。【方法】以表达载体pEGX-4T-1、pET-30a及猪囊尾蚴API基因的原核表达载体pEGX-4T-1/API-Flag、pET-30a/API为材料,对影响API蛋白表达的载体(pEGX-4T-1、pET-30a)、温度(25,30,37℃)、诱导时间(2,4,6,8h)、IPTG终浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和卡那霉素终浓度(100,200,300,400mmol/L)等条件进行优化,筛选重组蛋白最佳的表达条件。对在最佳条件下获取的目的蛋白进行超声处理,4℃、10 000r/min离心分别收集上清液和沉淀,对目的蛋白进行可溶性分析;SDS-PAGE后,将目的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上,与抗His标签抗体共孵育,检测目的蛋白的反应原性。【结果】当选择pET系列载体(pET-30a)时,API表达量高于其在pGEX系列(pGEX-4T-1)中的表达量。API融合蛋白最佳表达条件为:在含200mmol/L卡那霉素的LB培养基上于37℃培养3h后,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG,再于30℃诱导培养6h。SDS-PAGE结果表明,pET-30a/API融合蛋白分子质量约为53ku,与预期蛋白分子质量一致。Western-blot检测结果显示,重组蛋白pET-30a/API能够识别特异性抗体,显示获得了大量表达正确的目的蛋白。【结论】确定了API基因的最佳表达条件,获得了较大表达量的API融合蛋白。     

猪囊尾蚴MTsCL-1基因的原核表达

【目的】探讨原核表达猪囊尾蚴TsCL-1蛋白的生物学特性,为研究半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)在猪囊尾蚴与宿主相互关系中的作用奠定基础。【方法】将含有猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的pGEX-4T TsCL-1重组质粒转入大肠杆菌BL21进行表达,诱导后的重组菌裂解上清通过谷胱甘肽（GST）琼脂糖亲和层析法进行纯化,纯化产物利用明胶蛋白电泳法进行活性检测。【结果】经SDS-PAGE分析显示,猪囊尾蚴TsCL-1基因表达的重组蛋白相对分子质量约为61 ku,表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的57.4%。表达产物应用GST琼脂糖凝胶纯化后,纯化蛋白的纯度可达90%以上。明胶蛋白电泳结果显示,纯化蛋白对明胶具有水解活性,并且其水解活性能被半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E-64抑制。【结论】从重组菌中成功表达了目的蛋白,该蛋白具有明显的水解活性,且E-64对其水解活性有抑制作用。     

猪囊尾蚴18kD蛋白基因的克隆及其序列分析

为在体外获得高纯度的猪囊尾蚴病的诊断抗原,克隆了猪囊尾蚴18kD蛋白的基因,并对其核苷酸和氨基酸序列进行了分析,揭示了18kD蛋白为一种分泌表达蛋白,为该蛋白的体外表达提供了基础。     

猪cGAS基因的克隆与原核表达

【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使cGAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫。通过构建含猪cGAS基因的重组质粒pBbB3a-His6-NusA-cGAS,进行原核表达,得到cGAS蛋白,为进行体外催化合成cGAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏cDNA为模板克隆猪cGAS的蛋白编码区 (open reading frame, ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21 (DE3)中。当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-NusA-cGAS融合蛋白,用20 mmol·L^-1丙酸钠在20℃,180 r/min分别诱导0, 2, 4, 6, 8, 10 h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 mmol·L^-1的丙酸钠在20℃,180 r/min诱导6 h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L^-1丙酸钠,180 r/min培养6 h,以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】（1）本试验成功克隆了猪cGAS基因,其ORF长度为1 494 bp;（2）构建了cGAS丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-cGAS;（3）His6-NusA-cGAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L^-1丙酸钠,诱导6 h时表达量最高。（4）His6-NusA-cGAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 kD。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了cGAS融合蛋白,本试验为体外表达cGAS融合蛋白提供技术方法。     

PRRSVGP5基因的优化、表达及其表达产物的免疫学活性分析

PRRSV GP5基因含有一段信号肽及3个跨膜功能区,这些区域可以使翻译的GP5停留在内质网,从而抑制其表达.根据实验室分离测定的PRRSV T1株GP5基因序列进行优化设计,通过人工合成获得GP5-ShortDNA并构建表达载体pGEX-GP5,将其转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达获得约41kD的目的融合蛋白.通过Western-blot检测,结果显示该融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有免疫学活性.研究结果为PRRSV基因工程苗的研究奠定了基础,同时也为基因的优化提供了借鉴.     

甜樱桃黄酮醇合酶基因的克隆及其表达分析

为了解黄酮醇合酶在甜樱桃类黄酮生物合成途径中的作用,根据其他物种已知的FLS cDNA保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE的技术,从甜樱桃(Prunus avium.L)嫩叶中扩增获得FLS cDNA全长,命名为PaFLS(GenBank登录号:JQ289290).该基因cDNA全长为1 077 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸,分子质量为38 ku,等电点pI为5.58.生物信息学分析表明PaFLS属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族(2OG-FeII_Oxy),该基因所编码的氨基酸序列与苹果、梨和草莓的同源性分别为99％、97％和77％.将该基因重组到表达载体pGEX4T-1中进行原核表达,电泳检测到一条约为65 ku的融合蛋白(含27 ku的GST标签).组织时空表达分析表明,PaFLS在甜樱桃的花中表达量最高,这可能和黄酮醇参与花粉萌发及利于授粉有关.     

犬溶菌酶基因的克隆、原核表达及产物活性分析

为了探讨重组犬溶菌酶的活性及临床应用前景,人工合成犬溶菌酶基因,构建其原核重组表达载体pPROHTa-rcLYZ,进行原核表达并对表达产物进行活性分析。结果表明,合成的犬溶菌酶基因全长396 bp,编码132 aa;构建的表达载体pPROHTa-rcLYZ含有犬溶菌基因完整的ORF;重组犬溶菌酶的相对分子质量为16 ku;重组犬溶菌酶约占全菌总蛋白32％,纯化后占全菌可溶性蛋白的95％;重组犬溶菌酶最适pH值为6．2,最适温度为38℃,对溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的溶菌活力,对铜绿假单胞菌、链球菌、枯草杆菌等有一定的抑制作用,对白色念珠菌无抑制作用,对人工感染的犬大肠杆菌病有治疗作用。表明本试验获得了有活性的、具有一定潜在应用价值的犬溶菌酶。     

猪白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达及其生物学活性测定

【目的】在大肠杆菌中表达猪白细胞介素-2(pIL2),并鉴定其生物学活性。【方法】以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增IL-2基因。将猪IL-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-pIL2,并应用甲基噻唑基四唑(MTT)试验测定融合蛋白的生物学活性。【结果】以含有猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增出1条约420bp的带。所获重组质粒pGEX-pIL2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。SDS-PAGE电泳结果显示,可检测到相对分子质量约为42ku的GST-pIL2,Western-blot证实GST-pIL2能与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应。表达蛋白经薄层层析扫描分析,表达量约占菌体总蛋白的40%。MTT试验证实,表达产物经变性、复性后能极显著促进猪脾淋巴细胞增殖。【结论】猪IL-2基因在大肠杆菌中得到表达,表达的蛋白具有一定的生物学活性。     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

球形红细菌无机焦磷酸酶的原核表达、纯化及初步分析

无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,PPase)水解在许多生物大分子的生物合成过程中产生焦磷酸并释放能量,形成的热力学拉力可促进合成反应的进行。球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)无机焦磷酸酶(RsPPase)属于II型可溶性焦磷酸酶,钴离子对于其活性的维持具有重要的功能,而其活性调控及其表达对细菌生长的影响尚未报道。研究克隆、原核表达纯化RsPPase。结果发现,钴离子会导致谷胱甘肽S-转移酶(glutathione sulfotransferase,GST)标签不能进行蛋白酶切,且融合蛋白GST-PPase水解焦磷酸的催化效率较低(Km/kcat=2.0×104mol(/L.s));在球形红细菌胞内表达大肠杆菌焦磷酸酶(Km/kcat=5.5×107mol/(L.s))没有影响细菌的生长,暗示球形红细菌胞内PPase活性足够高。通过对其结构的模拟推测,在钴离子存在的情况下为闭合构象,GST标签的存在可能影响PPase羧基端结构域的运动,而影响其结合底物和释放产物的能力;在钴离子不存在的情况下为开放构象,GST标签具有较大的自由度,可暴露蛋白酶识别位点酶切产生无标签RsPPase。     

鸡 PD 1胞外区基因的克隆表达及其蛋白生物学活性鉴定

为研究鸡程序性细胞死亡因子1（PD 1）胞外区的生物学活性,根据 GenBank 中的鸡 PD 1基因序列,经生物信息学比对分析,设计鸡 PD 1胞外区特异性克隆引物,扩增目的基因,连接原核表达载体 pET 28a（＋）,构建重组表达载体 pET 28a PD 1,转化至 Rosetta（DE3）大肠杆菌,并对IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,对表达产物进行 SDS PAGE 和 Western blot 分析,应用流式细胞术对所获得重组蛋白的生物学活性进行鉴定。结果显示,成功克隆了鸡 PD 1胞外区基因;SDS PAGE 和 Western blot 分析结果表明,37℃、0．1 mmol/L IPTG 诱导4 h 时,PD 1胞外区融合蛋白表达量最高,以包涵体形式存在;流式细胞术分析结果表明,PD 1胞外区重组蛋白具有一定的生物学活性。     

绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。     

福寿螺多功能纤维素酶基因egx的克隆及其体外功能性表达

 【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。【方法】通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织总RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx序列,连接克隆载体pMD18-T,再通过Eco RⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体pET-32a（+）及pcDNA3.1（+）连接,构建原核、真核表达载体,并在E.coli BL-21（DE3）和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。【结果】RT-PCR扩增得到1 326 bp的序列,包括1 185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因cDNA序列相似性为99%,氨基酸序列相似性为100%。原核细胞表达产物经包涵体复性后,对羧甲基纤维素钠、2-羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、微晶纤维素、木聚糖的水解活性分别为：24.78、15.67、18.42、600.91和175.43 U•mg-1;而在PK15细胞中重组酶对以上5种底物的活性分别为：0.84、0.78、1.01、14.62和4.23 U•mL-1。【结论】克隆出了福寿螺多功能纤维素酶基因,并能在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功地表达。     

美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质

【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA12的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn~(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg~(2+)对Hc CDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co~(2+)和Fe~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe~(2+)激活作用越强,而Co~(2+)激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(Hc CDA2),在原核细胞中表达61 k D目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶Hc CDA1和Hc CDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0。     

鼠防御素基因Crp4在大肠杆菌中的表达及活性检测

通过基因工程技术,以鼠防御素基因Crp4为研究对象,从鼠回肠末端克隆了鼠防御素Crp4基因的成熟编码序列(约为102 bp),将其与另外2个鼠防御素基因的氨基酸序列进行比对,发现同源性分别高达97.8%和97.1%。将该序列克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组质粒pET-Crp4,转化DE3感受态并用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Wersiernblot结果表明,该基因在pET-28a中成功表达。体外抑菌试验证实,重组Crp4蛋白对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、大肠杆菌等具有一定的抑菌活性。     

肇东盐单胞菌中胞苷酸激酶基因cmk的克隆与功能分析

为探究一株中度嗜盐菌-肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)NEAU-ST10-25T的耐盐碱机制,采用基因文库筛选方法从该菌株获得一个重组质粒p UC-LYS1。该质粒可恢复大肠杆菌(Escherichia coli)Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc在含有0.2 mol·L-1Na Cl的LBK培养基上生长。序列分析显示,重组质粒p UC-LYS1中外源DNA片段由1个N端截短的ORF1、三个完整的ORF(ORF2-4)以及1个C端截短的ORF5组成。其中,ORF4与伸长盐单胞菌(Halomonas enlongata)中1个推测的胞苷酸激酶(Cytidylate kinase,CMK)同源性最高(86%)。为便于区分与其同源物,编码ORF4的基因cmk来自肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)被定名为Hz_cmk。Hz_CMK也与包括已被鉴定来自大肠杆菌(E.coli)的Ec_CMK等其他同源物具有较高同源性。为进一步鉴定Hz_cmk是否编码胞苷酸激酶,通过PCR扩增分别将Hz_cmk和大肠杆菌(E.coli)的同源基因Ec_cmk(作为正对照)构建至原核表达载体p ET19,转化到大肠杆菌(E.coli)C41(DE3)感受态细胞中诱导表达。SDS-PAGE表明其以可溶形式存在。酶学分析表明Hz_CMK与Ec_CMK均具有较高胞苷酸激酶活性。为国内外首次中度嗜盐菌的胞苷酸激酶基因功能鉴定。     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。