荻草谷网蚜两个内参基因的克隆及表达谱分析

利用染料法荧光定量PCR技术开展功能基因的表达量检测时,表达稳定内参基因的选择和引物的高特异性是确保检测结果准确可靠的前提。本文针对昆虫通用的内参基因NADH(nicotinamideadenine dinucleotide dehydrogenase)和DIMT(dimethyladenosine transferase)在荻草谷网蚜中进行了基因克隆、序列分析、不同龄期的时间表达谱分析和基因表达稳定性评估。两个基因的GenBank登录号分别为OL770461和OL770462。NADH和DIMT基因克隆序列与基于高通量测序技术预测结果高度一致,但仍有不同。以β-actin为内参分析两个表达谱,结果显示各自表达稳定、龄期间无显著差异;稳定值由高到低为β-actin,NADH,DIMT,稳定值彼此接近、远小于阈值1.5。以上研究结果说明,通常作为内参基因的持家基因虽然保守,在物种间仍可能存在较大变异,直接引用其他物种的内参引物不可行;不但如此,一代测序技术虽然通量低但准确度极高,与之相比,二代高通量测序则错误率较高,因此引物设计使用的基因应首做克隆测序验证;最后,NADH和DIMT在荻草...     

成株期小麦对荻草谷网蚜的田间抗蚜性和耐蚜性评价

为拓展和获取对荻草谷网蚜Sitobion miscanthi表现稳定的小麦抗源,以我国146个小麦品种（系）为材料,利用2020年麦田蚜虫发生严重的机会,采用有蚜株蚜害级别计算抗蚜指数,采用耐蚜值（调查株蚜害级别/千粒重损失率）计算耐蚜指数,以此评估小麦的抗蚜性水平和耐蚜性水平;2022年利用人工辅助接蚜的方法对2020年表现稳定的部分小麦品种（系）的评估结果进行验证。结果显示,在自然感蚜条件下2个试验点6次调查中仅山农116、泉麦31和濮麦116表现稳定的抗蚜性,在人工接蚜时仅郑麦132表现稳定的抗蚜性;中育1220、泰禾麦2号和瑞华1408在自然感蚜时蚜量较低,千粒重损失率低于5.00%,人工接蚜亦表现良好的耐蚜性,表明其兼具耐蚜性和一定的抗蚜性;泰麦601、瑞华592、轮选166和中农麦4007在自然感蚜的高蚜量情况下和人工辅助接蚜时均能保持较低的千粒重损失率（小于15.00%）,表明成株期小麦的抗蚜性减弱是一种普遍现象,耐蚜性是比抗蚜性更稳定的遗传特征。     

异色瓢虫显明变种对荻草谷网蚜和禾谷缢管蚜捕食选择性研究

在实验室条件下,在特定空间内,测定异色瓢虫显明变种对两种蚜虫荻草谷网蚜和禾谷缢管蚜不同密度值下的捕食量。结果表明,荻草谷网蚜和禾谷缢管蚜种群数量同步增加时,EG-S值和EI值变化是从1到∞,EI值是在0到+1范围内依次增加,表明异色瓢虫显明变种喜好捕食荻草谷网蚜明显高于禾谷缢管蚜;荻草谷网蚜数量不变,禾谷缢管蚜数量增加时,EG-S值和EI值是从+1到0,EI值从-1到0范围内依次减少,表明异色瓢虫显明变种明显喜好捕食禾谷缢管蚜;禾谷缢管蚜数量不变,荻草谷网蚜数量增加时,EG-S值和EI值变化从+1到∞,EI值在0到+1范围内依次增加,表明异色瓢虫显明变种明显喜好捕食荻草谷网蚜。捕食量结果同选择指数。     

紫外线、高压静电和大麦黄矮病毒胁迫下荻草谷网蚜SOD基因表达

为探索环境胁迫影响昆虫适合度的内在机制,通过cDNA末端快速扩增（rapid amplification of c DNA end,RACE）技术克隆得到荻草谷网蚜Sitobion miscanthi体内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）基因MnSOD和CuZnSOD的cDNA序列全长,对该序列进行分析,检测紫外线、高压静电和大麦黄矮病毒（barley yellow dwarf virus,BYDV）胁迫下荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD基因表达量的变化。结果显示,荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD基因的cDNA序列全长分别为1 517 bp和954 bp(GenBank登录号分别为MT533627和MT533626),开放阅读框分别为669 bp和459 bp,分别编码222个和152个氨基酸,预测蛋白质相对分子量分别为24.99 kD和15.84 kD。荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD蛋白均与半翅目蚜科昆虫同源蛋白氨基酸序列相似性高,亲缘关系最近。0.50 m W/cm2（低强度）和0.70 m W/cm2（高强度）紫外线胁迫下...     

荻草谷网蚜体内杀虫剂抗性相关基因的分析及其功能验证

为了解荻草谷网蚜Sitobion miscanthi体内与杀虫剂靶标和代谢抗性相关的基因信息及其在不同发育阶段的表达情况,通过转录组测序选出不同发育阶段差异性表达的抗药性相关基因,并采用荧光定量PCR和RNA干扰技术对选取的5个抗药性相关基因进行功能验证。结果显示,共获得与杀虫剂靶标和代谢相关基因374个,其中在3龄若蚜体内上调表达基因有129个。CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2和nAChR α2-3基因在3龄若蚜、无翅成蚜和有翅成蚜体内的表达量比在1龄若蚜体内的表达量均显著上调。GST1-1基因在3龄若蚜和有翅成蚜体内的表达量比在1龄若蚜体内的表达量显著上调。荻草谷网蚜3龄若虫经吡虫啉处理后,CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2和GST1-1的表达量均显著上调,而nAChR α2-3的表达量显著下调。沉默CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2及GST1-1后蚜虫对吡虫啉的敏感度增加,而沉默nAChRα2-3后蚜虫对吡虫啉的敏感度降低,表明CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2、nAChR α2-3和GST1-1这5个基因均可能与...     

半固体人工饲料饲养日本通草蛉幼虫对荻草谷网蚜捕食作用

为评价一种半固体人工饲料饲养的日本通草蛉幼虫的捕食潜力,在室内研究了1~3龄幼虫对荻草谷网蚜的捕食作用和种内干扰作用。结果表明,1~3龄幼虫的捕食量随着猎物密度的增加而上升,当猎物密度增加到一定水平,捕食量趋向稳定,捕食功能反应曲线均符合Holling Ⅱ型方程。不同龄期幼虫对荻草谷网蚜理论最大日捕食量分别为42、179、204头。2龄幼虫的干扰效应用Hassell &Varley的模式(E=QP^-m)进行模拟,模拟模型为E=0.5074P^-0.6627,结果说明随着2龄幼虫密度的增大,其捕食作用率随之减小。     

基于线粒体和初级共生菌基因序列的荻草谷网蚜6个地理种群的遗传多样性研究

荻草谷网蚜Sitobion miscanthi (Takahashi)(在中国长时间学名误用为麦长管蚜Sitobion avenae Fabricius)是我国小麦的主要害虫,为小麦蚜虫优势种。该蚜虫因繁殖速度快、发育历期短、适应能力强且能随着气流远距离迁飞等特性,对小麦安全生产构成严重威胁。目前关于蚜虫种群遗传结构的研究主要基于线粒体基因开展。然而,初级共生菌布赫纳氏菌Buchnera aphidicola几乎存在于所有蚜虫中,其在研究蚜虫种群遗传结构多样性方面的潜在作用报道很少。本研究基于前期收集的荻草谷网蚜6个不同地理种群(苏州、武汉、昆明、廊坊、泰安、银川),对其线粒体COⅠ基因与初级共生菌B.aphidicola的两个单拷贝基因gnd与trpA进行PCR扩增、测序和群体遗传结构分析。根据对3个遗传标记基因聚类分析,荻草谷网蚜6个不同地理种群分为3组,分别为银川种群、苏州种群和其他种群(COⅠ: FCT= 0.364 2,P <0.05;gnd:FCT= 0.403 3,P <0.05;trpA:FCT= 0.222 9,P <0.05),3组间存在显著的遗传差异。银川种群和泰安种群间有相同的稀有单倍型H8(trpA),苏州种群和武汉种群也有相同的稀有单倍型H2与H23 (COⅠ),3组之间仍存在基因交流。因此我们推测在4、5月份东南季风盛行的情况下,银川种群迁入了外来虫源。蚜虫线粒体基因和初级共生菌基因的遗传结构分析结果基本一致,表明共生菌基因在研究蚜虫种群遗传结构和多样性具有潜在应用意义。综上所述,基于线粒体和共生菌基因序列的荻草谷网蚜不同地理种群的遗传结构解析可为蚜虫的迁飞提供分子证据。     

豌豆蚜特异性扩张分支气味受体基因的克隆及表达分析

豌豆蚜Acyrthosiphon pisum气味受体家族存在明显扩张现象,推测在豌豆蚜寄主适应过程中起着重要作用。本研究旨在克隆豌豆蚜特异性扩张分支上的气味受体基因,明确这些气味受体基因在不同组织中的表达水平。通过PCR技术克隆特异性扩张分支上气味受体基因的全长序列,采用实时荧光定量RT-qPCR技术测定这些基因在触角及足中的表达水平。克隆获得豌豆蚜特异性扩张分支中4个气味受体基因全长序列(GenBank登录号：OL739156-OL739159),分别编码374～376个氨基酸,序列相似性较高,为68.09%～83.11%,均具有7个跨膜结构域。荧光定量RT-qPCR结果显示ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在豌豆蚜成虫触角及足中均有表达,其中ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在触角中偏好表达,ApisOR13基因在触角中的表达量最高。本研究为解析豌豆蚜特异性扩张气味受体的功能提供了分子基础。     

禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的克隆、分子特性和表达分析

为探究禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi (Linnaeus)水通道蛋白基因RpAQP1的序列特征及其在不同龄期的表达,利用RT-PCR和RACE技术克隆了RpAQP1基因的cDNA全序列,采用生物信息学软件分析了RpAQP1编码蛋白的特性,利用qRT-PCR分析了RpAQP1在不同龄期的表达量。结果显示:禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的cDNA全长为1 216 bp,其750 bp的开放阅读框编码250个氨基酸,蛋白分子量为27.36 kD。RpAQP1属于水通道蛋白亚家族DRIP(果蝇内嵌蛋白Drosophila integral protein)的一员,具有6个跨膜区,2个保守的NPA结构单元和1个压缩区域Ar/R;qRT-PCR结果显示,RpAQP1在整个发育历期均有表达,其在2龄若蚜中表达水平最高,是成蚜表达量的1.432倍;在4龄若蚜中表达量最低,为成蚜表达量的0.444倍,显著低于其它龄期,而其余各龄期RpAQP1表达量无显著差异。     

禾谷缢管蚜RpGST1基因的克隆、序列分析及原核表达

为揭示禾谷缢管蚜耐药性的分子机理,采用RT-PCR方法克隆了禾谷缢管蚜谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)的cDNA序列,命名为RpGST1(GenBank登录号KP192850),并构建原核表达载体pET32-RpGST1,对RpGST1基因进行原核表达、SDS-PAGE和Western blotting检测。结果显示,禾谷缢管蚜RpGST1基因的编码区长651 bp,编码216个氨基酸,分子量约为24.06 kD,理论等电点为6.20;RpGST1基因在大肠杆菌中成功表达出一个分子量约为45 kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。通过克隆RpGST1基因的cDNA序列并进行序列比对分析,表明构建了GST基因的原核表达载体并成功表达。     

梨小食心虫气味受体GmolOR10基因克隆及表达谱分析

为研究梨小食心虫Grapholita molesta Busck嗅觉通讯分子机制,本研究应用RT-PCR克隆获得了梨小食心虫气味受体基因GmolOR10的完整开放阅读框,并对其序列结构进行了相关生物信息学分析,最后采用实时荧光定量PCR对GmolOR10在梨小食心虫成虫不同组织(触角、头、胸、腹、足、翅)与不同发育阶段的表达模式进行了定量分析。结果表明,GmolOR10编码区长1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点和相对分子量分别为8.57和46.14 kD,有7个跨膜结构域。多序列比对与系统发育树结果显示GmolOR10与卷蛾科苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR18和山毛榉卷叶蛾Cydia fagiglandana CfagOR18的氨基酸序列一致性较高,分别为84.38%和83.38%。GmolOR10在雄成虫触角中表达量较高,极显著高于雌虫触角(P<0.01),在雌、雄成虫头部也有较高的表达量,在成虫其他组织表达量很低。不同发育阶段的表达谱显示,GmolOR10在梨小食心虫的不同发育阶段均有表达,在成虫期的表达量最高(在雌雄成虫中的表达量均呈现出随着...     

麦长管蚜电压门控钠离子通道基因克隆及序列分析

克隆获得麦长管蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列,明确其典型特征,为研究麦长管蚜抗性分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆麦长管蚜钠离子通道基因cDNA序列,利用DNASTAR Lasergene 7.10软件对其序列进行分析。克隆得到两条cDNA序列SaNa_v1和SaNa_v2（GenBank登录号分别为MN176137和MN161584）,SaNa_v1序列长3423 bp,共编码1141个氨基酸;SaNa_v2序列长2874 bp,共编码958个氨基酸。同源比对发现,SaNav1与禾谷缢管蚜和桃蚜的第一部分钠离子通道基因相似度分别高达97.81%和97.91%;SaNav2与禾谷缢管蚜和桃蚜的第二部分钠离子通道基因相似性高达97.90%和96.43%。所克隆序列包含4个同源结构域,每个结构域6个跨膜片段（S1～S6）,存在钠通道选择性关键残基“DENS”。本文成功克隆了麦长管蚜中钠离子通道基因,为麦长管蚜钠离子通道抗性机制的研究提供依据。     

Cloning and expression analysis of the ATP-binding cassette transporter gene MFABC1 and the alternative oxidase gene MfAOX1 from Monilinia fructicola

Brown rot, caused by Moniliniafructicola (G Wint) Honey, is a serious disease of peach in all commercial peach production areas in the USA, including South Carolina where it has been primarily controlled by pre-harvest application of 14-alpha demethylation (DMI) fungicides for more than 15 years. Recently, the Qo fungicide azoxystrobin was registered for brown rot control and is currently being investigated for its potential as a DMI fungicide rotation partner because of its different mode of action. In an effort to investigate molecular mechanisms of DMI and Qo fungicide resistance in M fructicola, the ABC transporter gene MfABC1 and the alternative oxidase gene MfAOX1 were cloned to study their potential role in conferring fungicide resistance. The MfABC1 gene was 4380 bp in length and contained one intron of 71 bp. The gene revealed high amino acid homologies with atrB from Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, an ABC transporter conferring resistance to many fungicides, including DMI fungicides. MfABC1 gene expression was induced after myclobutanil and propiconazole treatment in isolates with low sensitivity to the same fungicides, and in an isolate with high sensitivity to propiconazole. The results suggest that the MfABC1 gene may be a DMI fungicide resistance determinant in M fructicola. The alternative oxidase gene MfAOX1 from M fructicola was cloned and gene expression was analyzed. The MfAOX1 gene was 1077 bp in length and contained two introns of 54 and 67 bp. The amino acid sequence was 63.8, 63.8 and 57.7% identical to alternative oxidases from Venturia inaequalis (Cooke) Winter, Aspergillus niger van Teighem and A nidulans, respectively. MfAOX1 expression in some but not all M fructicola isolates was induced in mycelia treated with azoxystrobin. Azoxystrobin at 2 microg ml(-1) significantly induced MfAOX1 expression in isolates with low MfAOX1 constitutive expression levels.     

小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析

全蚀病是小麦上一种重要的土传病害。选育和种植抗病品种是防治小麦全蚀病的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。根据基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全长序列设计引物扩增‘新农19’的cDNA,获得了完整ORF,编码85个氨基酸残基,比对后发现与TaWIR1b序列同源性达100%。根据获得的TaWIR1b基因全长序列设计定量引物,分析TaWIR1b在全蚀菌胁迫条件下不同互作模式的表达特征。结果表明接种全蚀病菌后抗病小麦品种‘新农19’中TaWIR1b基因被诱导表达,接菌后3d达到峰值143.97,感病品种‘新麦19’中峰值出现在接菌后8d,表达量仅为对照的4.22倍,提示该基因可能参与小麦对全蚀病的抗病过程。     

半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用

采用同源序列克隆方法,通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1条1 069 bp的半夏凝集素基因pta,与以同科内植物的mRNA为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高,达到98%以上,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区,GenBank登录号AY725425。用该基因替换pBI121载体的GUS基因,正向插入35S启动子之下,构建了植物表达载体pBI-pta。通过农杆菌介导法转化烟草,从20株Kan抗性植株中得到PCR检测阳性植株14株,证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR阳性植株进行了抗蚜虫(Myzus persicae)筛选试验,结果表明:不同株系蚜口密度抑制率在22.5%~89.4%,平均蚜口密度抑制率56.2%。