百合花香合成相关基因LiMCS的克隆、定位和表达特性研究

百合花香中含有大量的萜类化合物,2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-环二磷酸合成酶（MCS）是合成单萜的甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径中的关键酶之一。为了进一步探究MCS在百合花香合成中的作用,克隆了‘西伯利亚’百合LiMCS基因,进行生物信息学分析,使用亚细胞定位确定该基因编码蛋白的位置,根据荧光定量PCR确定了该基因的时空表达模式。结果表明,LiMCS基因开放阅读框为669 bp,编码222个氨基酸,与盾叶薯蓣的相似度最高。LiMCS蛋白定位于烟草叶表皮细胞的叶绿体中。LiMCS基因在‘西伯利亚’百合花的半开期表达量最高,花蕾期最低;在盛开期,该基因在花瓣中表达量最高,在其他部位表达量较低。结果证明LiMCS可能参与百合花香单萜类物质合成,这为后续利用基因工程手段调控百合花香释放奠定了理论基础。     

东方百合‘索邦’组蛋白去乙酰化酶基因 LoSorHDA1的克隆与表达分析

以东方百合‘索邦’（Sorbonne）为材料,结合前期转录组数据,克隆组蛋白去乙酰化酶基因HDA1(Histone deacetylases),命名为LoSorHDA1。LoSorHDA1序列长1 518 bp,编码505个氨基酸,生物信息学预测含有一个高度保守的组蛋白去乙酰化结构域。系统进化分析表明,LoSorHDA1与拟南芥等物种的HDA1同源蛋白聚为一支,而与HDAC家族其他成员关系较远;LoSorHDA1编码的氨基酸序列与单子叶植物小果野焦（Musa acuminata）的相似度最高,而双子叶植物HDA1则聚为另一支。RT-PCR结果显示：LoSorHDA1在‘索邦’不同组织中普遍表达,其中在茎生根、嫩茎、花被片、花丝、柱头、花柱、子房中表达量较高,在下部叶和花药中表达稍弱。亚细胞定位表达结果表明,LoSorHDA1定位在细胞核和细胞质中。荧光定量PCR结果显示：LoSorHDA1在不同花发育阶段中的各个花部组织中均有不同程度的表达,在雌雄蕊中表达趋势相反,而在内外花被片中的表达趋势较为一致,说明LoSorHDA1可能参与东方百合花发育进程,这为后续LoSorHDA1的去乙酰化修饰在百合花发育中的功能研究奠定基础。     

‘西伯利亚’百合单萜释放与Li-mTPS表达日变化动态分析

使用动态顶空法采集‘西伯利亚’百合不同时间点（7:30、9:30、11:30、13:30、15:30、17:30、 19:30 ）释放的香气,采用自动热脱附-气相色谱/质谱联用（ATD-GC/MS）技术分析鉴定花香成分及释放量。结果表明:单萜释放量呈现先增后减的规律,11:30、13:30、15:30时的释放量较高。在所有的花香成分中,罗勒烯、芳樟醇和β-月桂烯的释放量最高,它们是‘西伯利亚’百合主要的单萜花香化合物。进一步研究发现,‘西伯利亚’百合花瓣中的Li-mTPS（一种百合单萜合成酶基因）的表达与单萜释放表现相似的规律。可见,Li-mTPS的表达在‘西伯利亚’百合主要的单萜释放中起着关键作用,而调控机制有待于进一步研究。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

卵形鲳鲹 SST1基因的克隆与组织表达

为了解卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus） SST1基因的生物学信息、胚胎发育不同时期的表达水平及其在组织中的表达和分布情况,进而探讨 SST1基因可能的生理功能及作用机制。对卵形鲳鯵基因组（登录号: PRJNA574895）中的 SST1基因（ID:EVM0001630）进行生物信息学分析,并对其在卵形鲳鯵胚胎发育的不同时期及其在幼鱼不同组织中的表达情况进行定量分析。结果表明,卵形鲳鲹的 SST1基因全长1 155 bp,开放阅读框序列长1 104 bp,共编码368个氨基酸,蛋白分子质量为41.42 ku,理论等电点pI为8.47,属于带正电的疏水性蛋白。SST1蛋白无信号肽序列,亚细胞定位主要于细胞质膜,属于膜蛋白,包含17个磷酸化位点,存在7个跨膜结构域,三维结构主体为7段α-螺旋并列扭曲排列成的一柱状结构。序列比对和系统进化树分析显示,卵形鲳鲹与黄尾鰤和高体鰤共聚于一个分支,氨基酸序列同一性分别为98.39%和  98.37%。定量PCR分析结果表明, SST1在卵形鲳鲹胚胎发育的前13个时期微量表达,进入初孵仔期表达量迅速升高。 SST1在卵形鲳鲹幼鱼不同组织中的表达量差异极显著,其中在脑组织中表达量最高,其次是卵巢和精巢,在背鳍、皮肤、肌肉等其他11个组织中的表达量相对较低。说明 SST1在卵形鲳鲹神经内分泌、性腺发育及生殖细胞发生过程中可能发挥着重要作用。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

中华鲟促甲状腺激素β亚基基因（TSHβ）cDNA序列的克隆及其表达分析

【目的】克隆中华鲟(Acipenser sinesis)促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因,分析其序列特征和进化特征,研究其在中华鲟中的组织表达特征和不同年龄垂体中的差异表达,为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE),克隆中华鲟TSHβ,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发生分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对TSHβ-mRNA在中华鲟肝、心、脾、性腺、肠、垂体、下丘脑、中脑、端脑、小脑和延脑等组织中的表达状况,以及在1,3,5龄中华鲟个体垂体中的表达差异进行研究。【结果】克隆获得TSHβ基因,该cDNA序列全长649bp,5′和3′端非编码区分别为142和75bp;开放阅读框432bp,编码143个氨基酸。TSHβ亚基成熟多肽含有12个半胱氨酸(Cys)和2个N连糖基化位点。氨基酸序列多重比对表明,中华鲟TSHβ与促滤泡激素β亚基和促黄体激素β亚基的一致性分别为36%和35%,但与糖蛋白激素α亚基的一致性约为10%。与其他脊椎动物的TSHβ氨基酸序列进行比对发现,中华鲟TSHβ亚基与西伯利亚鲟一致性最高(98%);与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类的序列一致性分别约为44%,55%,56%和60%;脊椎动物TSHβ的Cys和N连糖基化位点位置高度保守。TSHβ亚基仅在中华鲟垂体中有表达;3龄雄性个体垂体中TSHβ的表达量约为1龄的9倍,3龄和5龄雌性个体垂体中的表达量均约为1龄的5倍左右。【结论】成功获得了中华鲟TSHβ亚基基因,该基因具有与其他动物TSHβ相似的结构和表达特征;雄性个体表达量高于雌性个体,其在中华鲟个体的生长发育过程中表达量上升。     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

黄鳝csf1r基因的克隆及时空表达特征分析

【目的】克隆黄鳝csf1r基因,并对其时空表达特性进行分析,为探明csf1r基因在黄鳝不同体色形成中的作用奠定基础。【方法】采用RACEs（Rapid-amplification of cDNA ends）技术从黄鳝皮肤cDNAs中克隆得到csf1r基因的全长cDNA序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测csf1r基因在黄鳝不同组织、不同发育时期胚胎或个体及3种体色黄鳝（黄黑斑鳝、碎花斑鳝和隐花斑鳝）皮肤和肾脏中的相对表达量,分析该基因的表达特征。测定3种体色黄鳝肝脏中的碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC）。【结果】黄鳝csf1r cDNA序列全长为4 430 bp（GenBank收录号：OP589303）,其编码区长度为2 937 bp,编码978个氨基酸,存在免疫球蛋白结构域和蛋白激酶催化结构域2个保守结构域。荧光定量PCR结果表明,csf1r基因在黄鳝脑、精巢、卵巢、肠、心脏、肾脏、肝脏、肌肉、皮肤和脾脏等组织中均有表达,在脾脏和心脏中表达量较高,其次是肾脏、皮肤和肌肉,卵巢中表达量最低;csf1r在胚胎眼晶体形成期开始大量表达,显微观察发现该时期胚胎的躯干上开始有色素颗粒出现。在3种体色黄鳝皮肤和肾脏中,csf1r基因在黄黑斑鳝的皮肤中表达量最低,而在其肾脏中表达量最高。3种体色黄鳝肝脏氧化应激指标测定结果发现,黄黑斑鳝肝脏中的碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力比其他2种体色黄鳝高,但是差异未达显著水平。【结论】csf1r基因可能不仅参与了黄鳝体色的形成,还与黄鳝非特异性免疫相关。     

大丽轮枝菌VdLac基因克隆与功能分析

为探讨漆酶基因VdLac在大丽轮枝菌中的功能,克隆该基因并利用农杆菌介导的遗传转化方法和PEG介导的原生质体转化方法对VdLac进行敲除和功能回复,获得敲除和互补突变体。以野生型JY为对照,对敲除突变体和互补突变体进行生物学功能测定。结果显示,VdLac基因全长1 978bp,cDNA序列全长1 713bp,编码570个氨基酸组成的蛋白质;VdLac基因缺失突变体(△VdLac)对硝化压力更敏感,其在CM培养基上仍可产生漆酶,但产生漆酶的能力降低;表明大丽轮枝菌漆酶基因VdLac不影响菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成。     

百合属的起源、分类及资源多样性

百合是世界著名的球根花卉,全世界有超过100种的野生种和9 000种的品种,这些资源中仅有不足50%用于育种,还有一些处于濒危状态。为使科研工作者和生产者深入了解百合,促进百合种质资源的保护和利用,分析了近年来国内外在百合起源、分类,以及生境、表型、遗传和功能多样性方面的研究进展,回顾了百合育种的4次突破,并指出我国在百合种质资源保护和利用方面存在的问题以及未来努力的方向。研究表明：1)百合在美洲的栽培历史似乎早于亚洲,我国可能是亚洲有百合记载最早的国家。已初步探明百合现代谱系的起源及其在美洲和欧洲的传播路径。2)基于形态学、细胞学、分子生物学特征及育种实践,百合属被分为轮叶组、根茎组、百合组、具叶柄组、卷瓣组、喇叭花组和斑瓣百合组等7个组。3)百合适应于多种生存环境,形成了丰富的表型、遗传和功能多样性。4)百合育种经历了亚洲百合、东方百合、组间杂种和花器官特化百合等4次突破。综上,利用百合资源的多样性,百合的种类得到了极大的丰富,但我国需加强百合野生资源驯化、世界百合资源利用和分子育种基础理论研究等方面的工作。     

致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05 Pfs基因的克隆、功能序列分析及原核表达

采用PCR技术从致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05基因组中扩增得到甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)基因的全序列,对其功能序列进行分析,同时与其他细菌相应序列及编码的氨基酸进行同源性分析,构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行反应原性分析。结果显示:XJ05的Pfs基因全长696bp,与XJ01、XJ08、XJ11,与屎肠球菌TX 2466之间的同源性在99.1%以上,其中,XJ05与V583为100%,且关键的功能序列相同,与肺炎链球菌同源性在55.8%以上、霍乱弧菌同源性在55.0%以上;pfs基因编码231个氨基酸,XJ05、XJ01、XJ08、XJ11与肺炎链球菌、霍乱弧菌、粪肠球菌V583、屎肠球菌TX 2466的同源性在86.43%以上;构建的重组质粒经诱导后表达蛋白分子量为28ku,Western blot检测显示特异性条带。结果表明,表达的融合蛋白具有良好的反应原性。     

意大利蜜蜂amPGI基因的克隆与表达分析

葡萄糖-6-磷酸异构酶（PGI）是糖酵解和几丁质合成途径中一种发挥重要作用的蛋白酶,为了探究意大利蜜蜂amPGI基因的分子特征及其在不同品级、不同发育时期的表达情况,采用RT-PCR技术克隆意大利蜜蜂葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（amPGI）,应用生物信息学方法分析其序列特征;进一步通过 RT-qPCR技术检测amPGI基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期的表达模式。结果显示,克隆获得amPGI基因序列全长1 674 bp,共编码557个氨基酸。序列分析发现,amPGI与大蜜蜂PGI氨基酸序列相似度达到 96.3%,蛋白结构以α-螺旋为主,且含有2个保守结构域和9个磷酸化位点,是一种结构稳定的非分泌型的亲水性胞内蛋白。表达模式显示amPGI基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期均有表达,且差异显著 （P<0.05）,工蜂中幼虫期5日龄表达量最高,雄蜂中成虫期表达量最高,蜂王中幼虫期6日龄表达量最高,不同品级卵前期和蛹期表达量均较低,且卵的孵化和蛹的羽化过程中amPGI基因表达量都急剧增加。综上推测amPGI基因在意大利蜜蜂精巢和卵巢的发育及几丁质的合成过程中具有重要作用。     

文心兰OnRR10基因的克隆及表达分析

为了鉴定控制文心兰花瓣衰老的关键基因,从文心兰花瓣中提取总RNA,利用RACE技术,得到OnRR10基因（登录号:MN337795）。该基因全长630 bp,编码209个氨基酸大小的蛋白质。蛋白质二级结构分析表明,OnRR10蛋白为亲水性蛋白,定位于细胞核中。同源序列比对及系统进化分析显示,OnRR10基因属于YesN家族。兰科中,OnRR10蛋白与小兰屿蝴蝶兰OnRR10亲缘关系最近。实时荧光定量分析表明,OnRR10基因在文心兰花发育的A时期（花苞期）和F时期（衰老早期）表达量达到最高值;基因表达似不受生物钟控制;细胞分裂素处理后表达分析表明,短时间内受6-BA刺激基因表达量急速上升。结果表明,OnRR10基因可能通过细胞分裂素作用而参与文心兰花瓣衰老过程。     

三角梅CHS基因的克隆及表达分析

查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）为花青素苷合成途径的关键酶,是观赏植物花色改良分子育种的研究热点。随着生物技术的发展转录组测序技术成为快速克隆新基因的有效手段,以''新加坡大白''三角梅苞片转录组数据库为基础,筛选克隆CHS基因,利用生物信息学方法预测分析其蛋白的结构与功能,通过实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同花色三角梅中的表达模式。结果表明:获得的CHS基因cDNA全长1 176 bp（GenBank ID：MT302539）,编码一个43.96 ku的蛋白,定位于细胞质中,含有CHS特征基序及活性位点,三级结构预测显示为二聚体蛋白,系统进化树分析结果显示与同为中央种子目的植物亲缘关系较近,符合系统进化关系。qRT-PCR显示该基因在黄色叶片中的表达量是红色叶片的24倍,表明黄色更适用于花青素途径的研究。研究结果为三角梅花色改良基因转化受体的筛选提供参考。     

棉花茉莉酸羧基甲基转移酶基因克隆及其表达分析

根据亚洲棉石系亚1号的转录组测序结果,克隆获得陆地棉品种"新陆早17号"的茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)全长cDNA,命名为GhJMT(GenBank登录号KJ856913)。序列分析表明,GhJMT基因开放阅读框为1 116bp,编码371个氨基酸。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有甲基转移酶-7保守结构域。系统进化树分析显示,GhJMT与可可的茉莉酸甲基转移酶在同一分支,可能定位于细胞质,为不稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,2.5%PEG6000胁迫处理12h时,根中GhJMT基因的表达迅速上调并达到最大值,约为对照的2.6倍,在茎中GhJMT的表达量在9h达到最高,约为对照的2.3倍,而在叶中GhJMT表达量在3h达到最高,约为对照组的2.1倍,说明GhJMT基因表达受干旱胁迫的诱导。研究结果有助于阐明GhJMT基因表达与植物抗旱的相关性。     

FaesCAL基因在同型长花柱甜荞中的表达分析

为探究同型长花柱甜荞花的发育调控的分子机制,从同型长花柱甜荞中分离得到1个全长984 bp的CAL同源基因cDNA 序列,命名为FaesCAL。FaesCAL基因包含长726 bp的完整开放阅读框,编码1个由241个氨基酸残基组成的MADS-box转录因子。蛋白序列比对及系统发育分析结果表明：FaesCAL 蛋白属于MADS-box转录因子中的CAL进化系,包含1个由57个氨基酸残基组成的高度保守的 MADS 结构域和1个由68个氨基酸残基组成的次级保守区域的 K 结构域。通过实时荧光定量(qRT-PCR)检测FaesCAL基因在同型长花柱甜荞中的组织表达特异性显示:FaesCAL基因主要在根、雄蕊、花被片和5 d果实中表达,在雌蕊中表达量很低,在茎和叶片中不表达,并且在雄蕊和花被片中的表达量极显著高于其他组织（LSD, P<0.01）。进一步通过qRT-PCR检测FaesCAL基因在甜荞花芽分化5个关键时期表达量的动态变化显示：FaesCAL基因的表达量在开花前雌雄蕊成熟时表达量最高,在雄蕊花丝的迅速伸长和花被片原基的出现时期的表达量其次。推测该基因参与了甜荞的成花转变,并在雄蕊以及花被片的发育中发挥作用。     

GhCDPK4基因的克隆和功能分析

为了研究棉花中GhCDPK4基因在响应非生物胁迫中所起的作用,通过PCR的方法克隆GhCDPK4基因,利用基因重组技术,构建植物过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,分析干旱和盐胁迫处理对转基因烟草表型和生理生化指标的影响。本研究成功克隆了属于棉花CDPK家族的基因GhCDPK4,构建了植物过表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK4。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现转基因烟草中GhCDPK4基因高水平表达,并且转基因烟草相比于野生型烟草表现出较强的耐旱和耐盐性,其中SOD、POD和CAT活性显著升高,而相对电导率和MDA含量降低。研究结果表明GhCDPK4基因可正向参与应答干旱和盐胁迫。