NtQPT基因对烟草形态及光合特性影响的研究

本研究以含CaMV 35S启动子启动烟草QPT超量表达载体pSH-35S-QPT和含CaMV 35S驱动烟草QPT干涉表达的植物表达载体pSH-35S-QPTi的工程农杆菌分别对烟草进行遗传转化。通过对不同生育期2种转基因烟草形态及光合测定发现,QPT干涉表达烟草的株高、茎围等形态指标均显著低于QPT超量表达和野生型植株。其中,以旺长期转干涉片段35 S∷QPTi转基因烟草植株的株高、茎围指标差异最为显著(p0.01),分别比野生型和超量表达植株低31.77%、27.51%和42.0%、36.78%。此外,干涉植株的开花时间比野生型和超量表达烟草延迟10~15d。干涉植株的最大净光合速率分别比野生型和超量表达植株低40.26%和44.51%,差异均达到显著水平(p0.05)。另外,干涉植株的叶绿素a和类胡萝卜素含量也出现显著降低,为野生型的71.07%和72.80%。     

棉花脂肪酸合成酶基因GhKAR和GhENR表达载体构建及其功能初探

酮脂酰ACP还原酶(β-ketoacyl-(ACP)reductase,KAR)和烯脂酰ACP还原酶(β-enoyl-(ACP)reductase,ENR)是脂肪酸合成过程中2个关键的还原酶,主要负责脂肪酸碳链的延伸。为明确棉花同源基因的功能,克隆了陆地棉Gh KAR和Gh ENR基因,并构建表达载体;应用花粉管通道法转化棉花,经过PCR检测和Southern杂交,筛选出阳性单拷贝植株,分析其后代株系中目的基因对油分含量以及抗寒性的影响。通过对转基因T4株系含油量的测定,发现转基因株系种子的含油量比野生型对照提高10.2%~14.1%,与对照差异极显著。通过气相色谱法分析转基因株系种子的脂肪酸成分,发现不饱和脂肪酸含量比野生型对照增加4.04%~6.02%。测定4℃低温胁迫下各个转基因株系不同时间生理指标的变化,结果表明:转基因株系的相对电导率和脯氨酸含量积累明显高于对照,而丙二醛含量低于对照,在不同胁迫时间与对照表现出显著或极显著差异,过表达的转基因株系的抗寒性有所提高。     

转LEA基因烟草的NaHCO3抗性分析

本研究以转LEA基因烟草7个株系及非转基因对照烟草组培苗为材料,用不同浓度的NaHCO3处理,通过调查转基因烟草和对照烟草的相对电导率、POD活性、SOD活性、碱害指数、生根率等指标的变化,对LEA基因功能在NaHCO3的抗性方面进行初步探索性的研究。结果表明,在非碱胁迫条件下,各转基因株系与对照烟草的相对电导率差异不明显,各株系的相对电导率随着NaHCO3浓度的增加均呈上升趋势,但各转基因株系均小于对照烟草,当NaHCO3浓度在30mmol/L和40mmol/L时,转基因株系之间及转基因株系与对照间的差异达到了显著水平;在给予NaHCO3胁迫后,将各转基因株系各个处理POD活性、SOD活性取平均值后与对照烟草做比较,可以看出,对照烟草的POD活性、SOD活性变化较小,而转基因株系活性上升较为明显,且均在NaHCO3浓度为30mmol/L处达到活性最大值;在不同浓度NaHCO3胁迫下转基因烟草的受害程度明显小于对照;在相同浓度的NaHCO3胁迫下,转基因烟草生根较对照烟草早2￣3d,当NaHCO3浓度为30mmol/L时,转基因烟草碱害指数达到50%左右,且保持有10%￣30%左右生根率,而对照烟草受害程度较大,已经不能生根。综合以上分析结果表明,转基因烟草NaHCO3的耐受临界浓度为30mmol/L。在NaHCO3胁迫下,转基因烟草的碱害程度、膜损伤较对照烟草小,POD、SOD活性及生根率均高于对照烟草,说明LEA基因的导入提高了烟草的NaHCO3抗性。     

水稻OPR基因的克隆及其在烟草中抗镉性分析

12-氧-植物二烯酸还原酶是茉莉酸生物合成途径的一个关键性酶,广泛参与植物生长过程中生物与非生物胁迫。本研究主要探讨OPR基因在植物非生物胁迫中的作用。从水稻中克隆了OPR基因,该基因的cDNA编码区全长1 203 bp,编码400个氨基酸,将其连接到植物表达载体pSH 737上,通过农杆菌介导的方法,将含有目的基因的载体遗传转化烟草,获得31株转基因植株。选取生长状况基本一致的8株不同转基因株系和4株野生型烟草,在非生物胁迫下,用300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液浇灌处理,观察植株生长并对抗镉能力进行初步分析;选取T 1代3个转基因株系(TP 7、TP 8和TP 12)和野生型烟草的种子,放入含有3个不同浓度CdCl_2溶液的滤纸上萌发进行镉胁迫并统计发芽率。在300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液胁迫15 d后,种子发芽率比野生型高40%以上,转基因烟草的抗氧化酶活性显著高于野生型,丙二醛的含量显著低于野生型植株。利用RT-PCR方法分析相关基因表达情况,结果表明,在Cd~(2+)胁迫下,OPR,Snakin-2和GRP-2基因表达均上调,因此推测OPR基因的高表达是其具有高抗性的主要原因。OPR基因的过量表达使烟草提高了对重金属Cd~(2+)的抗逆性能力。     

导入外源玉米C_4型NADP-ME基因对小麦光合效能的影响

为研究玉米C_4型NADP-ME基因对小麦光合特性的影响,以T_3代转NADP-ME基因小麦株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4及其对照周麦23为试材,进行了分子特征鉴定、光合生理特性分析和单株产量性状调查,并对其作用机制进行了初步解析。结果表明,外源基因已整合到转基因小麦的基因组中,并能正确转录和翻译;与对照周麦23相比,两个转基因株系在4个测定时期旗叶NADP-ME酶活性均明显提高,而旗叶净光合速率(P_n)则明显下降;尤其在花后第7天,两个转基因株系的酶活性较对照分别提高1.33倍和1.13倍,P_n分别较对照下降17.26%和10.35%;千粒重和籽粒产量较对照均显著下降。与对照周麦23相比,转基因株系10T(9)-225-4利用强光和同化CO_2能力下降,光合效率下降;旗叶气孔张开率和气孔导度均显著下降;苹果酸含量降低了5.6%,丙酮酸含量则提高了17.1%;外施苹果酸可恢复其光合速率。以上研究结果表明,玉米C_4型NADP-ME基因的导入降低了小麦的光合特性,苹果酸含量降低引起的气孔导度下降可能是导致转基因小麦光合效能降低的原因。     

准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

中国水仙凝集素基因在大花烟草中的定量表达及抗蚜性分析

为了确定中国水仙凝集素基因NTL1的抗蚜功能及培育具有抗蚜功能的大花烟草,利用qPCR方法,研究了中国水仙凝集素基因(NTL1)在转基因大花烟草4个株系中的相对表达情况;利用自然感蚜、活体接种和离体接种方法研究了不同转基因株系的抗蚜能力。结果表明,NTL1在不同株系中的相对表达量差异显著,从高到低依次为3,4,1,2;抗蚜虫试验结果显示:转基因烟草具有一定抗蚜性,但不同烟草株系的抗蚜能力有所不同;活体转基因烟草单株与离体烟草叶片的平均蚜虫密度抑制率分别为8.22%~76.61%,4.62%~65.65%;转基因大花烟草可加速蚜虫的死亡。对比NTL1在不同转基因大花烟草株系中的相对表达量及抗蚜效果,发现NTL1在不同株系中的相对表达量与植株抗蚜性具有高度一致性。     

超量表达CsADH17基因提高烟草抗旱性及香气成分分析

乙醇脱氢酶是植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中的关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用,因此探究CsADH17基因有利于茶树的生长发育与品质提升。以本课题组前期筛选的CsADH17基因为研究对象,克隆CsADH17基因并构建植物表达载体,遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下CsADH17的表达量和相关生理指标进行测定与分析。结果表明,对转基因与野生型烟草进行模拟干旱胁迫后,转基因烟草植株在干旱胁迫处理下的CsADH17基因相对表达量比野生型植株高。野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理21 d后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均高于野生型烟草;胁迫处理后,野生型烟草叶片中丙二醛(MDA)含量显著高于转基因烟草。香气成分分析,转基因烟草苯甲醛比野生型含量提高了44.4%,而烟碱含量比野生型提高不到5%。CsADH17基因在烟草干旱胁迫下具有抗旱作用,同时影响烟草的香气成分,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

转betA基因增强小麦的干热风抗性

甜菜碱是细胞内重要的渗透调节物质,其积累能有效提高植物对非生物逆境的抗性。以转betA基因小麦和未转基因的野生型为材料,在灌浆期模拟干热风胁迫处理植株3 d,研究干热风对植株生长和籽粒产量的影响。胁迫处理后,转基因植株保持较好长势,叶片青枯失水较少,旗叶持绿面积显著大于野生型。各株系植株的光合作用能力和蔗糖磷酸合成酶(SPS)及蔗糖合成酶(SS)活性在胁迫处理后都下降,转基因植株的净光合速率下降到2.3~3.7 μmol CO₂ m^-2 s^-1,而野生型下降到1.2 μmol CO₂ m^-2 s^-1;野生型植株的SPS和SS活性的下降幅度分别为处理前56.8%和53.9%, 而转基因株系的下降幅度分别为62.3%~69.8%和56.5%~64.5%。干热风胁迫使得各株系植株的旗叶甜菜碱含量升高,但转基因株系的叶片甜菜碱含量比野生型的高18%~87%。在甜菜碱保护作用下,转基因植株在胁迫条件下能够维持较高的光合速率,合成较多的碳水化合物,使得百粒重和单株产量均高于野生型。因此,通过转betA基因可显著提高小麦在干热风处理条件下的甜菜碱含量从而增强其抗干热风能力。     

过表达截形苜蓿液泡膜H~+-PPase基因提高马铃薯的抗旱性

本研究以过表达截形苜蓿类型ⅠH~+-焦磷酸酶编码基因MtVP1的转基因马铃薯为材料,对其抗旱性进行了检测。结果显示:(1)在正常生长条件下,与野生型植株相比,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性差异均不显著,而脯氨酸含量均高于野生型植株,其中OE2株系脯氨酸含量显著高于野生型植株。随着干旱胁迫的持续,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量的下降趋势平缓,其含量均显著高于野生型对照,且两个转基因株系的脯氨酸含量和SOD活性显著高于野生型对照,而转基因株系的MDA含量显著低于野生型植株。(2)转MtVP1马铃薯表现出表皮毛增多的新表型,茎和叶表面的表皮毛明显比野生型植株多。以上结果表明,Mt VP1基因的过表达提高了马铃薯的渗透调节能力,从而增强了马铃薯的抗旱性;还表明植物类型ⅠH~+-焦磷酸酶基因可能参与调控其他的代谢通路,具有更复杂的生理功能。     

转EdHP1(氢离子焦磷酸化酶)基因烟草促进钾离子吸收的生理机制

钾是植物生长必须的重要矿质元素,提高作物对钾的吸收是提高作物产量的重要途径。本研究以前期遗传转化披碱草EdHP1(H+-pyrophosphatase)基因的烟草为材料,在低钾处理条件下比较了转基因烟草和野生型烟草的生理特性。结果显示,在低钾条件下,野生型烟草体内K+积累量只相当于转基因烟草的62.9%。野生型烟草的总根长、总根表面积、总根体积明显低于转基因烟草(P0.05),分别为转基因烟草的72.9%、68.1%和60.6%。在不同直径根系(0.5～2.0、2.5～4.5、4.5mm分别为细根、中等根和粗根)中,细根发育差异最大,野生型烟草为转基因烟草的72.9%。低钾条件下,转基因烟草根系活力是野生型烟草的1.2倍,野生型烟草根系焦磷酸化酶活力相当于转基因烟草的46.4%,根部游离IAA含量相当于转基因烟草的66.2%。通过非损伤方法测定根部K+和H+流速结果显示,在根系表面积相似情况下,低钾条件下野生型烟草外排钾速率显著高于转基因烟草,而氢离子外排速率显著低于转基因烟草。综上所述,发达的根系和较高的K+转运体活性综合作用显著提高了转基因烟草根部对K+的吸收。     

过量表达NtCAF1基因对烟草腺毛密度的影响

为研究NtCAF1基因对烟草腺毛密度的影响,本研究通过构建NtCAF1过表达载体,并对获得的过表达烟草植株进行分析。结果表明,NtCAF1(KC 480443)在烟草叶片中表达量最高;同时,构建NtCAF1过表达载体并通过农杆菌介导的叶盘法遗传化烟草,筛选获得过表达NtCAF1的阳性转基因株系19个;对这些转基因株系叶片腺毛密度进行统计发现,过量表达NtCAF1烟草叶片的腺毛密度较野生型而言显著增加70%;此外,与野生型相比,过量表达NtCAF1烟草叶片的脱落酸(ABA)和赤霉素(GA₃)含量也显著升高。然而,茉莉酸(JA)含量无显著差异。结果表明,NtCAF1可能通过ABA和GA₃激素介导调节烟草腺毛密度变化。     

叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性

根据已构建的大豆叶绿体表达载体pJY01,设计特异性引物,将昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149插入此载体中构成叶绿体表达载体pJY01-MpAFP149,利用基因枪轰击法转化烟草,经壮观霉素筛选获得4株叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草株系。PCR和PCR-Southern结果显示外源基因已整合至烟草叶绿体基因组中但同质化水平不高,RT-PCR结果也表明昆虫抗冻蛋白基因已发生了转录。将野生型烟草、叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草及核转化T₁代转抗冻蛋白基因烟草(pCAMBIA1302- MpAFP149)于–1℃低温处理3 d,观察耐寒表型及测定相对电导率。结果表明, 叶绿体型转基因烟草的耐寒表型优于野生型烟草,但与核转化的T₁代转抗冻蛋白基因烟草无显著差异。处理3 d时,叶绿体型转基因烟草和T₁代转抗冻蛋白基因烟草的电导率分别为39.2%和38.2%,而野生型烟草已达73.7%。本实验获得的异质化转叶绿体抗冻蛋白基因烟草与转核基因烟草的耐寒力无差异。     

转AtDREB2A基因苜蓿的耐碱性分析

对已获得的转基因苜蓿进行了RT-PCR检测,确定AtDREB2A基因已在转基因苜蓿中超量表达。并研究了转AtDREB2A基因苜蓿在碱胁迫(100mmol/L,pH8.5)下表型和生理生化指标的变化。结果表明,转AtDREB2A基因苜蓿的相对质膜透性及丙二醛含量显著低于野生型株系,株高、叶绿素及根系活力明显高于野生型株系,说明AtDREB2A基因的超量表达提高了转基因苜蓿的耐碱能力。     

PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用

为了明确磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)过量表达能否提高水稻的光合速率,测定了42个表达不同PEPC水平的转玉米PEPC基因水稻株系及对照(受体亲本中花8号)开花期和灌浆期的光合速率。结果表明,在水田条件下,转基因株系光合速率与未转基因对照相比没有明显差异;而在旱地条件下,转基因水稻的光合速率显著高于对照(27%和24%)。随机选取2个PEPC相对活性分别为10倍和25倍的转基因株系进行网室精确控水盆栽实验得到相似的结果。说明单纯导入PEPC并不能提高水稻的光合速率,而干旱胁迫下转基因水稻的光合优势可能是由于PEPC参与水稻的抗旱反应而减轻了干旱胁迫对光合作用的抑制作用。     

ZmLTP3基因对玉米的遗传转化及耐盐性鉴定

为探讨转脂蛋白在非生物逆境中的作用,将Zm LTP3基因利用花粉管通道法转入玉米自交系京2416中,在PCR和EPSPS速测试纸鉴定基础上连续自交获得转基因阳性株系。以转基因株系OE6、OE10、OE18作为试验组,以自交系京2416为对照(WT),进行盐胁迫处理,比较二者之间在形态指标和生理指标方面的差异。结果显示,在正常生长条件下,转基因株系与野生型的各项指标均无显著差异。在盐胁迫条件下,与野生型相比,转基因株系的株高、茎基宽、根长、鲜质量、干质量及叶绿素含量均显著增加,表现出较好的生长状态;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)活性也显著升高,显示出较高的活性氧清除能力;同时,丙二醛(MDA)含量及相对外渗电导率水平则显著下降,暗示其体内较低程度的细胞伤害水平。以上结果表明,Zm LTP3基因的过量表达可提高玉米的耐盐胁迫能力。     

大麦HvNRT2.3/HvNRT2.5基因对拟南芥生长发育及产量性状的影响

高亲和硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter, NRT)对于植物的氮代谢具有重要的作用。为研究大麦HvNRT2.3和HvNRT2.5基因的功能,本研究从大麦栽培品种‘Morex’克隆了大麦HvNRT2.3和HvNRT2.5基因,构建2个基因的超表达载体,转化拟南芥野生型(Col)。本研究测定了野生型和转基因株系的10个性状,结果显示超表达株系除株高没有显著变化外,转基因株系的莲座叶大小、荚果数目、长度、籽粒数目、千粒重、硝态氮含量和蛋白质含量等均显著增大或提高;成熟期单株干重分别增加45.63%和14.74%,单株籽粒产量分别提高31.37%和24.31%,收获指数较野生型没有显著变化。研究表明,过量表达大麦HvNRT2.3和HvNRT2.5基因能促进拟南芥生长,提高氮素的吸收能力和单株产量。     

过表达二穗短柄草BdDREB1-like基因提高烟草的抗氧化能力

为了研究二穗短柄草BdDREB1-like基因在转基因烟草中的功能,克隆了该基因,并进行了生物信息学分析。该基因开放阅读框684 bp,编码228个氨基酸,编码蛋白的分子量为24.178 ku,只含有一个典型的AP2结构域,属于AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-responsive element binding protein)超家族的DREB家族。多序列比对与进化分析显示它与黑麦ScCBFI的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明,BdDREB1-like基因定位于细胞核。将其构建到植物表达载体上,并通过农杆菌介导法转入烟草中。PCR和RT-PCR筛选鉴定显示BdDREB1-like基因不仅整合到烟草基因组中而且还能稳定表达。过氧化氢胁迫条件下,转BdDREB1-like基因烟草幼苗具有较高的发芽率。为了进一步确定BdDREB1-like基因与氧化胁迫的关系,又对一个月大的转基因烟草进行氧化胁迫(MV,甲基紫精)处理。结果表明,在正常生长条件下,T3转基因株系除了SOD含量外,测定的其他各种生理指标均与野生型无显著差异,T1转基因株系中只有POD和叶绿素含量与野生型中的有显著差异;而在氧化胁迫处理条件下,转BdDREB1-like基因的烟草植株相对于野生型具有较高的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和叶绿素的含量和较低的丙二醛和过氧化氢含量。这些结果表明,过表达BdDREB1-like基因增强了植物对氧化胁迫的耐受性。     

玉米胁迫诱导表达基因ZmSNAC1的功能分析

NAC转录因子是具有多种生物功能的植物特异转录调控因子,在植物生长发育、器官建成、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。我们之前分离得到1个受干旱、盐、冷等非生物逆境胁迫和植物激素ABA诱导显著上调表达的玉米NAC家族成员ZmSNAC1,过表达转基因株系在苗期的耐脱水能力较野生型株系明显提高。在此基础上,本研究进一步对ZmSNAC1过表达转基因株系在植株生殖生长发育时期的抗旱性和耐盐性进行功能鉴定。结果表明,在干旱胁迫条件下,野生型株系相比转基因株系较存活率提高50%~52%,相对电导率降低17%~21%,叶绿素含量提高36%~47%,脯氨酸含量提高了17%~23%;在300mmol L^-1 NaCl胁迫条件下,转基因株系的存活率提高36~40%。ZmSNAC1可能作为一个正向调控因子在逆境胁迫信号转导过程中发挥重要作用。