TALEN介导水稻OsTZF9基因定点突变研究

RR-TZF锌指基因在植物生长发育和胁迫反应中起着重要作用。利用TALEN基因组编辑技术定点突变水稻RR-TZF基因OsTZF9,结果表明:根据日本晴基因组中的OsTZF9基因序列,设计3对TALEN靶序列,并构建相应的3个TALEN植物敲除表达载体;通过农杆菌介导法分别将3个TALEN敲除载体导入水稻明恢86和秀水134的胚性愈伤组织中,获得了100个转化再生植株,PCR检测获得87个阳性植株;PCR扩增转基因植株靶突变区并测序列,发现所有转基因植株均未出现靶突变。     

BWMK1互作基因BWIP4对粳稻的转化

通过酵母双杂交体系,获得了7个BWMK1互作基因BWIP1~BWIP7.从中选取BWIP4作进一步的功能分析,构建了BWIP4-RNAi表达载体pANDA-BWIP4和超表达载体NCGR-1300-BWIP4,利用农杆菌介导法转化粳稻日本晴,获得了35个干涉株系和136个超表达转基因株系,对经PCR、GUS检测的阳性植株进一步进行RT-PCR检测,干涉株系中BWIP4的表达量低于日本晴,而超表达株系中BWIP4的表达量高于日本晴.     

水稻OsAPX基因的克隆及过表达载体的构建

通过RT-PCR法从粳稻日本晴中克隆到ascorbate peroxidase(APX)基因,该基因的cDNA长为768bp,包含完整的CDS序列。将克隆到的片段连接到植物表达载体pBI121的相应位置,构建1个APX基因的过表达载体pBI121-APX。利用农杆菌EHA105介导该植物表达载体在籼稻"多系1号"和"航1号"中的遗传转化,以期成功获得转基因植株,为后期研究APX基因在水稻耐储藏方面所发挥的功能打下基础。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

过表达转OsILP基因水稻株系的构建

采用RT-PCR和TA克隆技术,从水稻品种日本晴中扩增出类整合素候选基因(integrin-like protein,ILP)OsILP的cDNA片段。经测序鉴定,克隆获得的目的片段长为1 167 bp,包含完整的CDS,编码388个氨基酸,预测分子量43 ku。进而将该片段连接至表达载体pTCK303中,通过PCR鉴定与酶切验证,结果表明成功构建了pTCK303-OsILP过表达载体。并将表达载体质粒转化为农杆菌EHA105,再通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,获得了过表达转OsILP基因水稻株系。     

水稻类黄酮3'-羟化酶基因克隆及植物表达载体的构建

参考GenBank中发布的水稻品种日本晴位于10号染色体的F3’H基因序列设计特异引物,用PCR方法从水稻基因组中克隆F3’H基因片段,并将该片段克隆到pMD18-T载体进行测序和序列分析。结果表明,克隆的F3’H基因全长1 789 bp,GenBank登录号为HQ876708,该基因与日本晴基因组序列同源性为100%。分别将F3’H基因插入植物双元表达载体pPZP2Ha3(-)和pPZP2Ha3(+)中,获得F3’H基因正义和反义植物表达载体,同时转入根癌农杆菌中。该研究为利用农杆菌介导法转化F3’H基因,进一步研究F3’H基因功能奠定基础。     

水稻OsSAMT1基因的克隆及其遗传转化

采用RT-PCR法从水稻中成功克隆了1个水杨酸甲酯转移酶基因(OsSAMT1),构建了该基因的超表达载体,通过农杆菌介导法转化粳稻品种日本晴,获得10个转基因阳性植株.生物信息学分析结果表明,水稻基因组中共有12个OsSAMT1的同源基因,它们分别属于第6和第11号染色体上的2个基因族,而位于第2号染色体上的OsSAMT1基因与第6号染色体上的同源基因具有更高的相似性.     

Pib基因编码区功能的转基因初步鉴定

将Pib结构基因克隆到双元载体,构建了3个植物表达载体pNAR501、pNAR502和pNAR503,这3个载体分别携带由35S驱动Pib结构基因的外显子2-外显子3、5’端部分缺失外显子1和5’端部分缺失的外显子1-外显子2-外显子3的不同片段。应用农杆菌介导法获得水稻品种日本晴转基因植株30株,经PCR、Southern blot和后代潮霉素抗性分离检测确定外源基因已整合进水稻基因组。Tn代转基因植株分蘖期大苗离体叶片抗稻瘟病鉴定结果表明,含3个不同载体的转基因植株对稻瘟病E1、F1、G1生理小种的抗性都显著高于对照日本晴。T1代3至4叶期幼苗活体接种鉴定结果与Tn代离体叶片鉴定结果不同,对E1、F1、G1生理小种的抗性低于对照日本晴。     

筛选和转化药用野生稻TAC克隆获得耐旱水稻

【目的】利用分子生物学技术建立一种可有效转移药用野生稻有利基因的方法,为进一步大量开展利用药用野生稻有利基因提供技术基础。【方法】以植物抗性相关转录因子AP2/EREBP和bZIP家族基因保守序列为探针,采用同位素α-32P对探针进行标记,通过Southern 杂交对药用野生稻TAC文库进行第一轮筛选;所获得阳性克隆用地高辛标记的探针进行第二轮筛选;最后利用PCR方法对第二轮筛选所获得的阳性克隆进行验证。通过农杆菌介导法将阳性克隆转入栽培稻品种日本晴,利用TAC载体插入片段两端的抗性标记Hpt和SacB,通过PCR扩增检测和和Southern杂交对转化植株进行鉴定。采用PEG胁迫法和生理指标变化对转基因T2植株的芽期、苗期耐旱性进行鉴定。【结果】第一轮TAC文库筛选共获得1 073个阳性克隆,其中,以AP2/EREBP的保守序列为探针筛选出606个、bZIP为探针筛选出467个。对这些阳性克隆进行第二轮筛选,从中共获得147个阳性克隆,其中,AP2/EREBP为探针筛选出95个、bZIP为探针筛选出52个。PCR验证有103个阳性克隆能够扩增出目的片段,分别是利用AP2/EREBP设计的引物筛选出63个克隆和bZIP的40个克隆,阳性克隆得率分别为66.32%和76.92%。通过农杆菌转化,以编号为52D-M16和22D-P2（与AP2/EREBP相关）以及55R-A17、49R-O14和8-A24（与bZIP相关）的克隆转化水稻日本晴均获得转化植株,转化试验结果发现外源插入片段越大则克隆转化的成苗率越低。抗性鉴定、PCR和Southern杂交结果均证明外源片段已转入受体水稻品种日本晴中。芽期抗旱性鉴定表明R12-23、R15-41和R1-8 3份材料的耐旱性优于受体日本晴,苗期鉴定显示M63-9和R12-23的耐旱性较强。综合认为,R12-23具有较好的耐旱性。【结论】通过构建药用野生稻TAC文库并结合特异克隆筛选和遗传转化方法,可以进行有利基因的转移,结合进一步的育种,有望实现药用野生稻在育种上的利用。     

水稻vdac3基因超表达载体的构建和遗传转化

以构建水稻osvdac3基因超表达载体并获得超表达的转基因水稻植株为目标,通过PCR扩增将水稻osvdac3基因的全长片段克隆到植物表达载体,构建CaMV35S∶∶osvdac3∶∶rfp植物超表达载体.并以水稻YTB品种作为其遗传转化的受体,通过农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻遗传转化.结果表明,利用该方法成功构建了水稻osvdac3基因超表达载体,在此基础上获得了多个osvdac3基因超表达的水稻植株,并使用RT-PCR技术分析了阳性植株中osvdac3基因的表达水平.该研究结果为进一步研究水稻osvdac3基因蛋白的功能奠定了基础.     

水稻脂氧合酶-3基因启动子的特性分析

从栽培水稻品种越光中克隆了水稻脂氧合酶-3基因(Lox-3)的启动子,长度为1343bp,其序列与日本晴对应的序列完全相同。生物信息学分析表明,该启动子序列中包含受信号诱导的元件(G-box)、温度响应元件(CCGAAA)和水分胁迫响应元件(CACATG)等顺式作用元件;进一步构建了Lox-3基因启动子与gus和gfp基因的融合表达载体并获得转基因植株,发现报告基因在转基因植株的根、茎、叶、花药、种胚及种皮中均有表达,在萌发种子的胚和胚芽中也有表达,但在胚乳中不表达。此外,经ABA、NaCl及人工陈化处理后对报告基因的表达进行了定量分析,发现这些非生物胁迫可能通过诱导启动子顺式元件致使报告基因表达活性增强。     

过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热和抗旱能力的研究

 【目的】利用转基因技术研究转录因子OsbZIP60的生物学功能,为培育抗逆水稻、减轻高温干旱对水稻的伤害奠定基础。【方法】构建水稻OsbZIP60的过表达载体pHB-OsbZIP60,通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将其导入水稻品种日本晴,通过观察转基因植株和野生型植株在胁迫条件下的表型差异,分析其生物学功能。采用半定量PCR和荧光定量PCR检测OsbZIP60的表达模式以及其在转基因植株中的表达水平。【结果】在转基因植株中,OsbZIP60表达量明显高于野生型日本晴植株。OsbZIP60的表达受热信号诱导,在热激条件下,转基因植株的OsbZIP60表达量进一步升高。OsbZIP60在水稻各组织中均有表达,且在成熟植株叶片中表达量最高。转基因植株与野生型相比具有更强的抗胁迫能力,并且离体部分失水率更低。【结论】水稻转录因子OsbZIP60在水稻热胁迫和干旱胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsbZIP60能够增强水稻的抗热和抗旱能力。     

OsKAT3 RNAi转基因水稻植株的构建

[目的]本研究以水稻‘日本晴’为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻气孔调控型钾吸收通道OsKAT3进行功能研究。[方法]通过将OsKAT3与拟南芥和水稻中的KAT类钾通道进行同源性比对,找到编码此蛋白基因C端的一段特异区域,并用于OsKAT3 RNAi表达载体的构建。设计含有相应酶切位点的引物扩增该特异片段,以OsKAT3作为模板进行RNAi-OsKAT3顺式和反式目的片段的PCR扩增。经菌落PCR鉴定挑选阳性克隆后送测序,测序结果表明:RNAi-OsKAT3顺式和反式目的片段均已正确连接到p MD19-T载体上,分别利用SacⅠ/SpeⅠ和Bam HⅠ/KpnⅠ酶切RNAi-OsKAT3顺式和反式目的片段,并将其连接到含有发夹结构的质粒p TCK303上,然后采用农杆菌介导的方法将经酶切验证正确的OsKAT3RNAi表达载体转化到水稻‘日本晴’中。[结果]以表达载体p TCK303多克隆位点两侧的通用引物进行转基因阳性植株鉴定,PCR结果显示OsKAT3顺式和反式特异片段已成功整合到再生水稻植株基因组中,定量PCR结果也证实RNAi转基因植株中OsKAT3基因表达被成功抑制。[结论]通过RNAi技术成功沉默了OsKAT3基因并获得T0代种子,为后续研究该基因功能奠定了一定基础。     

转人表皮生长因子基因红花研究

【目的】制备转人表皮生长因子(Human epidermal growth factor,hEGF)基因红花植株,为利用植物生物反应器规模化生产hEGF奠定基础。【方法】利用分子生物学方法将植物偏好的双基因hEGF克隆至表达载体pOP上,构建了重组质粒pOP-hEGF-hEGF,采用冻融法将质粒pOP-hEGF-hEGF转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导方法转化红花,采用PCR检测、Southern blot筛选转基因红花阳性植株。【结果】成功构建了植物特异表达载体pOP-hEGF-hEGF,通过转化红花子叶,共获得了30株转基因红花植株,其中3株鉴定为阳性,转化率为10%;对转化植株进行分子生物学检测,从DNA水平检测结果可知,hEGF基因已整合进红花基因组中。【结论】获得了转hEGF基因的红花株系。     

水稻OsWAX2—1基因过表达及RNAi研究

为了研究水稻OsWAX2-1基因的功能,采用农杆菌介导法,以日本晴为材料,利用OsWAX2-1基因过表达及RNAi载体进行了遗传转化,并以PCR及半定量RT-PCR方法对具有Hyg抗性的转基因水稻植株进行了检测,结果表明:OsWAX2-1基因及RNAi片段均已整合到水稻基因组,RT-PCR检测到转OsWAX2-1基因在T1代转基因水稻中有不同程度的过表达,为进一步研究OsWAX2-1基因的功能奠定了基础.     

利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因

以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点,优化改造了相应的载体及其构建方法,实现了两步法构建基因敲除载体。利用新的载体和方法,针对水稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica cv.Nipponbare)D3基因的3个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体,并通过农杆菌介导的遗传转化成功获得一系列转基因植株。T_0代转基因植株靶位点测序结果显示,靶位点DDRC1包括5种突变类型,植株的突变率为35.48%;靶位点DDRC2包括5种突变类型,植株的突变率为25.00%;靶位点DDRC3包括1种突变类型,植株的突变率为20.00%。利用T_1代纯合突变植株,进一步研究了所得纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系,探讨了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点,为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料提供了参考。     

转火龙果过氧化氢酶基因烟草植株的获得及其抗旱性分析

根据前期克隆的火龙果过氧化氢酶基因(HuCAT)设计特异引物,从克隆载体PMD18T-HuCAT中扩增出特异带,将其连入植物表达载体pSH737,构建了CaMV35s启动子驱动的表达载体pSH737-HuCAT;采用农杆菌介导法转化烟草,获得37个抗性植株,经GUS组织化学染色及PCR扩增鉴定,有29个株系为转基因植株;经半定量RT-PCR及荧光定量PCR检测,筛选出高表达株系22个;以PEG-6000溶液模拟干旱胁迫条件,测定转基因烟草的抗旱相关生理指标,结果显示,转基因烟草CAT活性、SOD活性、POD活性、PRO含量和相对含水量均高于野生型烟草,MDA含量低于野生型烟草,表明转HuCAT基因可能提高了烟草的抗旱性.     

水稻osvdac基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

[目的]构建水稻osvdac3和osvdac5基因RNA干涉表达载体,获得转干涉载体的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到osvdac3和osvdac5的分别靠近5’端和3’端约500～600bp的特异序列,用Gateway重组克隆技术构建RNA干涉表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]成功构建水稻2个osvdac3和2个os-vdac5基因RNA干涉表达载体,并获得转osvdac3干涉载体的阳性植株。[结论]干涉osvdac3和osvdac5的植株为研究其功能提供材料。     

水稻锌指蛋白基因OsZRL过表达对根系发育的影响

锌指蛋白是目前研究最为深入的一类转录因子,在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究克隆了水稻的一个锌指蛋白转录因子基因(OsZRL),并构建OsZRL基因过量表达载体,通过农杆菌介导法转入野生型水稻品种日本晴,获得转基因阳性分化植株。其中一些转基因小苗因根系不能正常发育而死亡,经定量分析这些转基因株系中OsZRL基因表达量显著高于野生型,初步表明锌指蛋白基因OsZRL与水稻根系发育有关。     

RNAi和GroEL介导的双价转基因番茄对TYLCV的抗性

本研究将已构建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2植物表达载体共转化番茄,共获得19株卡那霉素抗性再生植株。经过PCR和RT-PCR检测,初步获得转SUC2-GroEL载体的阳性植株5株,转pBI121-AC1-AC2载体的阳性植株3株以及转SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2双载体的阳性植株2株。利用TYLCV侵染性克隆农杆菌注射接种法对T0代转基因阳性植株进行抗性鉴定,获得抗TYLCV的转基因植株7株。对T0代未扩出病毒条带的T1代植株进行抗性鉴定,结果发现转SUC2-GroEL、pBI121-AC1-AC2、SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2不同载体的株系植株中平均带毒率依次是35%、25%和15%,推断转双基因的植株的抗病能力优于转单个基因植株的抗病能力。