家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16的表达规律及体外重组表达

家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。     

家蚕丝腺发育相关基因Bmsage缺失突变体的RNA-seq分析

Bmsage是在家蚕丝腺中特异表达的基因,之前的研究明确其对丝素重链基因fib-H转录具有调控作用。在开展Bmsage功能的研究中,运用CRISPR/Cas9基因敲除系统,获得了Bmsage缺失的纯合突变体家蚕,其表型特征是幼虫的丝腺异常发育,缺失中部丝腺和后部丝腺。以Bmsage缺失型家蚕及正常型家蚕产下后5 d的卵为材料,应用RNA-seq测序技术在转录水平上获得194个差异表达基因。对Bmsage缺失型家蚕突变体胚胎期的这些差异表达基因进行GO功能注释,结果显示:Bmsage基因缺失后,对家蚕生理功能的影响主要集中在一些细胞组分,如与肌肉功能相关的肌球蛋白基因和肌钙蛋白基因都明显上调表达,与碳水化合物代谢相关的基因如多种凝集素基因和糖苷酶基因,除个别下调表达外,其余均上调表达;排在前10的GO term中,出现较多的是与几丁质分解代谢相关的几丁质酶基因和多种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。KEGG信号通路分析显示:差异基因主要与一些糖类、脂类和氨基酸的代谢的信号通路相关,其中又以糖类代谢为主,如半乳糖代谢、糖胺聚糖降解及氨基糖和核苷酸糖代谢,所以Bmsage可能参与了多个糖类代谢途径;在差异基因中,与丝腺发育关系最大的是几丁质酶基因、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,以及一些转运RNA基因(如TRNAE-CUC、TRNAN-GUU、TRNADGUC和TRNAV-GAC)。因此推测Bmsage可能通过复杂的调控网络,参与了丝腺组织的分化与形成过程。     

丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的研究进展

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)是一类分子质量在40~50 k D的蛋白酶抑制剂。已知动物、植物、古细菌、细菌、病毒的基因组中都有serpin基因家族存在,Serpin被认为是参与免疫调节和其他生物学通路的重要因子。迄今为止,Serpin家族已发现了1 500余个成员,分为抑制型和非抑制型两大类。其中,抑制型Serpin采用不可逆的自杀性机制抑制靶蛋白酶,而非抑制型Serpin的作用方式多样。Serpin独特的构象变化使其易于发生突变而导致蛋白质的错误折叠、无活性聚合物形成等,且已证实一些Serpin家族成员因构象改变和聚合导致的疾病。家蚕(Bombyx mori)和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中都存在多拷贝的serpin基因。本文综述Serpin在不同物种中的分布,Serpin的结构、功能、作用机制、与其相关的疾病等,以及家蚕和家蚕微孢子虫的Serpin的研究进展。     

不同家蚕品系的胰蛋白酶抑制剂种类与活性的多态性分析

胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI)广泛存在于昆虫体内,可抑制胰蛋白酶的水解活性。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白酶活性染色的方法,研究不同家蚕品系的丝腺、同一品系家蚕的不同组织器官及不同发育时期丝腺中胰蛋白酶抑制剂种类和活性的多态性,以丰富家蚕丝蛋白的合成、分泌及保护机制研究的基础信息。在22个家蚕品系上蔟第2天的蚕体丝腺中,共检测到6种胰蛋白酶抑制剂,分别命名为TI-Ⅰ~TI-Ⅵ,其中大部分家蚕品系都有TI-Ⅵ,有TI-Ⅳ的品系也较多,而有TI-Ⅱ的品系最少,家蚕不同品系间TI的种类分布不一致;在幼虫5龄期,TI活性随着丝腺的发育逐渐增强;在家蚕品系大造上蔟第1天蚕体的7个组织器官中,只在血液、精巢和丝腺中检测到TI,其中血液和丝腺中各检测到2种TI,精巢中检测到1种TI,而且同一家蚕品系含有TI的组织器官中的TI种类也不一致。对茧丝中3种TI(TI-Ⅲ、TI-Ⅳ和TI-Ⅵ)的理化性质进行检测,发现不同种类TI对温度及p H的适应范围不同,其中TI-Ⅵ的适应范围较广。研究结果显示:不同家蚕品系丝腺中含有的TI种类以及6种TI活性的强弱表现出多态性;同一家蚕品系不同组织器官中的TI种类也具有多态性;温度和p H对不同TI的活性影响程度不同。     

家蚕丝素重链启动子克隆片段在家蚕体内和昆虫培养细胞内的渗漏表达

为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部;克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光;克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。     

重要外文学术期刊发表蚕学论文简介

<正>1 ZHOU Q Z,FU P,LI S S,ZHANG C J,YU Q Y,QIU C Z,ZHANG H B,ZHANG Z.A comparison of co-expression networks in silk gland reveals the causes of silk yield increase during silkworm domestication. Front Genet,2020,11:225.DOI:10.3389/fgene.2020.00225题目家蚕与野蚕丝腺共表达网络的比较分析揭示了家蚕驯化过程中丝产量增加的原因摘要长期驯化和选择性育种使家蚕的产丝量是其野生祖先野桑蚕产丝量的几倍。然而,人们对驯化过程中蚕丝产量增加的分子机制知之甚少。根据家蚕和野蚕丝腺功能分化的动态模式,重庆大学ZHOU等发现在丝腺发育的早期和中期,家蚕中的表达上调基因主要涉及与细胞分裂和生长相关的DNA整合、核酸结合和转运蛋白活性,这导致家蚕的后部丝腺(PSG)细胞(丝蛋白合成"工厂")显著多于野蚕。在丝腺发育的后期,家蚕中的表达上调基因在蛋白质加工和核糖体途径富集,表明在家蚕驯化过程中蛋白质合成效率得到了提高。虽然家蚕丝腺中的丝素蛋白合成增加,但丝胶蛋白的产量也同时减少。这反映了家蚕和野蚕处于不同的选择压力下。重要的是,发现家蚕丝蛋白基因共表达的网络比野蚕的大。此外,在家蚕中与丝蛋白基因共表达的基因比在野蚕中更多地受到人工选择。研究结果表明,在家蚕驯化过程中,蚕丝产量的增加与生物系统的改善有关,该系统不仅包括蛋白质合成"工厂"(PSG细胞)的扩大,还包括丝蛋白基因和丝生产相关基因(如生物能量、运输和核糖体途径基因)的高表达。     

钙蛋白酶抑制蛋白对猪肉品质的影响

钙蛋白酶蛋白系统是影响肌肉生长和宰后肉嫩化的一个重要因素,主要由钙蛋白酶(μ-calpain和m-calpain)、钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)及骨骼肌特异性钙蛋白酶组成,钙蛋白酶抑制蛋白是一种内源性专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白,参与了调控肌原纤维蛋白的降解并在其中发挥了关键作用。本文概述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构、功能及其对肌肉蛋白质的增加、提高肉嫩度的作用。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

家蚕5龄幼虫期乙酰化修饰丝胶蛋白对蚕丝性能的影响

乙酰化修饰即在翻译中或翻译后的蛋白质分子链上嫁接乙酰基团,是通过化学修饰改变蛋白质性质的方式之一,丝胶蛋白是高度乙酰化的蛋白质。以丝腺组织大量合成丝蛋白的家蚕5龄第2天幼虫供试,分别将去乙酰化酶抑制剂TSA和乙酰化酶抑制剂C646自幼虫第2腹节注射入体内丝腺,上调和下调丝胶蛋白的乙酰化水平,探究通过乙酰化修饰丝胶蛋白的方法改善蚕丝性能的可行性。收集试验组家蚕的茧丝进行力学性能测试、红外光谱分析、X射线衍射分析、扫描电子显微镜(SEM)观察,结果证实丝胶蛋白的乙酰化修饰并不会改变蚕丝丝素的晶体结构,但具有增强丝胶与丝素表层附着力的作用。研究结果可为蚕丝精练脱胶和染整工艺的改进提供新的理论依据。     

家蚕4眠期与5龄期后部丝腺细胞蛋白质组成分析

为探讨家蚕丝腺细胞合成分泌蛋白质过程中有关基因的表达调控机理,采用蛋白质双向电泳和图像分析技术,研究了家蚕4眠期和5龄期后部丝腺细胞的蛋白质组成。在4眠家蚕的后部丝腺细胞中检测到425个蛋白斑点,5龄期随着生长发育的进程,可检测到新的特异蛋白斑点,说明不同的发育时期,后部丝腺细胞的蛋白组成是不一致的。5龄前、中期新增加的特异蛋白斑点可能与丝素蛋白的合成、分泌有关,而5龄后期新增加的特异蛋白斑点可能与丝腺组织的形态变化、细胞的分解凋亡有关。     

Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用

微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库中获得全部成熟体Bmo-miR,通过生物信息学分析筛选到一个对BmS er-1有潜在调控作用的BmomiR,命名为Bmo-miR-2771。设计茎环引物,采用半定量RT-PCR方法检测Bmo-miR-2771及其预测靶基因BmS er-1在家蚕5龄3 d幼虫头部、脂肪体、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、中肠等组织器官以及血淋巴细胞中的表达水平,结果显示Bmo-miR-2771特异性地在中部丝腺中表达,并且靶基因BmS er-1在中部丝腺的相对表达量也明显高于其他组织。将构建的表达BmomiR-2771的重组质粒pcD NA3.0(ie1-egfp-pri-miR-2771-SV40)和表达BmS er-1 3'-UTR的重组质粒pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTRSV40)共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,并以共转染pcD NA3.0(ie1-egfp-SV40)和pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTR-SV40)的BmN细胞为阳性对照,以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,检测荧光素酶活性,结果显示实验组的荧光素酶活性相对于阳性对照组显著降低(P0.05),从细胞水平证实了Bmo-miR-2771对BmS er-1基因表达具有负调控作用。     

家蚕丝素基因的研究进展

家蚕丝素蛋白基因不仅高度专一地在后部丝腺中表达，而且在家蚕胚胎发育及幼虫发育过程中，丝素蛋白基因的表达在时间和空间上受到精细的调控，因此研究丝素蛋白基因的调控方式，能使我们了解生物体如何利用遗传信息，对基因进行时间和空间上的表达调控。调控丝素蛋白基因表达专一性的启动子／增强子结构相对较为简单，也更利于研究。本文就近年来在家蚕丝索蛋白基因研究中取得的成果进行综述。     

钙蛋白酶抑制蛋白与肉嫩度相关性

钙蛋白酶蛋白系统是影响肌肉生长和宰后肉嫩化的一个重要因素,主要由钙蛋白酶(μ-calpain和m-cal-pain)、钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)及骨骼肌特异性钙蛋白酶(muscle specific calpain,P94)组成,钙蛋白酶抑制蛋白是一种内源性专一抑制钙蛋白酶(calpain)活性的蛋白,参与了调控肌原纤维蛋白的降解并在其中发挥了关键作用。本文概述了钙蛋白酶系统、钙蛋白酶抑制蛋白的结构、功能及其对提高肉嫩度的作用。     

旋毛虫Serpin基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化及虫体表达特性

为研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin),基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化,本研究应用实时荧光定量PCR技术对不同发育时期的虫体的Serpin在mRNA表达水平进行检测。同时利用鼠抗重组蛋白血清对Serpin在旋毛虫成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫及肌幼虫中进行定位,以鉴定该Serpin基因的表达特性。研究结果显示,在成虫时期,3 d时表达量明显高于6 h和5 d的表达量(P﹤0.05);成囊前期表达量很低,其中18 d时表达量最低(P﹤0.05);肌幼虫时期在26 d、38 d和48 d均有大量表达(P﹤0.05)。免疫荧光染色结果表明,Ts Serpin蛋白在5 d成虫期的体表表达;在新生幼虫和14 d成囊前期幼虫的体内体表均有表达;38 d肌幼虫时期明显可见表皮及体内均有表达。本实验为探究旋毛虫在宿主体内免疫逃避机制奠定基础。     

钙蛋白酶抑制蛋白在动物营养中的研究进展

钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)是一种有着多种功能的内源抑制剂,它通过抑制钙蛋白酶(calpain)的活性而发挥作用,参与骨骼肌的生长调节与肌肉嫩度的调控。本文综述了钙蛋白酶抑制蛋白的生物学结构、活性调控机理以及其与营养的关系等。     

家蚕丝腺Matchmaker cDNA文库的构建和3种蚕丝蛋白基因转录因子编码区的克隆

采用Clontech公司SMARTTM技术,分别构建了家蚕4龄眠蚕后部丝腺(PSG0)以及5龄第3天后部丝腺(PSG3)、中部丝腺(MSG3)和脂肪体(FAT3)的Matchmaker cDNA文库,用A3基因引物对几个文库的质量进行了检测;从cDNA文库和家蚕基因组中克隆了FMBP-1、POU-M1和BmFkh 3种在蚕丝蛋白基因表达调控中起重要作用的转录因子编码区,并对其序列进行了分析。结果表明,所建cDNA文库能够用于利用酵母的杂交系统开展蚕丝蛋白基因的表达调控研究。     

家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究

对家蚕中部丝腺小RNA高通量测序获得若干新miRNA,生物信息学分析发现Bmo-miR-0047可能对家蚕丝胶蛋白基因Bm Ser-1有调控作用。设计特异性茎环引物,利用半定量RT-PCR检测分析家蚕5龄3 d幼虫丝腺(包括前、中、后部丝腺)、头部、脂肪体、表皮、中肠、马氏管、精巢/卵巢、血淋巴细胞和气管等12个器官组织中Bmo-miR-0047的表达情况。结果显示,中部丝腺中Bmo-miR-0047的相对表达量明显高于其他组织,说明在家蚕5龄幼虫期Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因的表达调控存在时空特异性。为了进一步分析Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因表达的调控作用,构建重组表达载体pc DNA3.0(ie1-egfp-pri-miR-0047-SV40)和p GL3(A3-luc-Bm Ser-1 3'UTR-SV40),并以海肾荧光素酶报告质粒pRL-CMV为内参,利用家蚕卵巢培养细胞Bm N进行共转染。转染后检测发现实验组Bm N细胞中的荧光素酶活性与对照组相比显著减弱,表明Bmo-miR-0047在体外培养细胞中对Bm Ser-1基因的表达具有负调控作用。     

PI3K/AKT/TORC1信号通路对丝素蛋白合成转录因子SGF1表达的影响

SGF1(silk gland factor 1)是一种转录调控因子,属于Fox家族的Fox A亚家族成员,能够启动丝素基因的表达,合成丝素蛋白。已知果蝇和其他高等动物中的PI3K/AKT/TORC1信号通路可以调控Fox转录蛋白的表达。为了探究家蚕幼虫后部丝腺(PSG)中PI3K/AKT/TORC1信号通路对SGF1表达水平的影响,对4龄第4天和5龄第7天家蚕幼虫分别注射信号通路抑制剂Wort、Rapa和LY294,24 h后解剖取出后部丝腺,一组用于免疫组织化学染色实验,另一组用于提取蛋白质进行Western blot检测。免疫组织化学染色实验表明,与对照组相比,注射3种信号通路抑制剂的家蚕幼虫后部丝腺组织的绿色荧光亮度明显减弱;Western blot检测表明,与对照组相比,实验组家蚕幼虫后部丝腺的蛋白质浓度有所下降。综合以上结果初步得出PI3K/AKT/TORC1信号通路抑制剂处理均可降低家蚕幼虫后部丝腺中SGF1表达的结论,即提示可以通过上游信号通路PI3K/AKT/TORC1影响SGF1的表达水平,进而调控丝素蛋白的合成。     

家蚕绵茧突变品系中部丝腺的差异蛋白组学分析

为了获取与家蚕绵茧突变形成相关蛋白质的基础信息,采用蛋白质双向电泳技术对结茧性状具有明显差异的正常茧、绵茧、丝胶茧3个家蚕品系5龄期幼虫中部丝腺不同区段的蛋白质进行双向电泳(2-DE)分析,图谱中的蛋白点主要集中在分子质量14～70 kD、等电点(pI)4～9的区域。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对部分表达量差异显著的蛋白点进行鉴定,获得35种可信的蛋白质,绵茧突变品系与正常茧、丝胶茧品系相比表达量有显著差异的蛋白质包括参与能量代谢、蛋白质合成等生物学过程的功能蛋白质,其中丝氨酸蛋白酶抑制剂16(serpin16)和丝氨酸蛋白酶抑制剂18(serpin18)可能与家蚕绵茧突变形成相关。     

外源蜕皮激素和保幼激素类似物对家蚕丝腺蜕皮激素受体基因表达活性的影响

为了进一步探讨外源蜕皮激素（Moulting hormone,MH）和保幼激素类似物（Juvenile hormone analogue,JHA）处理家蚕的增丝机理,本试验分别于5龄24h注射植源性MH和5龄72h注射JHA,采用半定量RT-PCR方法,测定了蜕皮激素受体（ecdysone receptor,EcR）（BmEcR-B1型）基因在家蚕5龄不同发育时期在中部丝腺和后部丝腺中表达量的变化。结果表明,正常对照家蚕丝腺中,EcR基因的表达均在5龄前期表达量较低,中后期表达量较高,但丝腺不同部位,表达模式不同。5龄24h用MH处理后,无论是中部丝腺还是后部丝腺,EcR基因的表达活性与对照组相比,总体上均是先上调后下降;而5龄72h用JHA处理,EcR基因的表达一直到对照熟蚕前均低于对照区;但两种处理区在对照区熟蚕之后仍有不同程度的表达。说明外源激素可通过影响MH受体基因的表达,从而影响了MH信号转导,进一步影响丝蛋白的合成。