苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及 生物信息学分析

不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。通过DNA重组技术,从Bt HZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%~99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%~99.74%。对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。     

杜梨S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆与生物信息学分析

以杜梨为试材,采用同源序列法和RACE技术对杜梨SAMDC基因进行了克隆,命名为PbSAMDC,GenBank登陆号为:JX624260.生物信息学分析表明,PbSAMDC基因全长l 683 bp,编码358个氨基酸,相对分子量为39.767 7kDa,等电点为4.96;其编码氨基酸同源性分析表明,PbSAMDC基因与MdSAMDC1同源性最高,达到96％,其次是葡萄、甜橙等,同时对该基因的生物活性等进行了讨论,研究对梨属植物SAMDC基因的逆境调控机制和抗逆基因工程育种具有重要意义.     

测定枯草芽孢杆菌生产中温α-淀粉酶方法的研究

通过在60℃,pH值7.0条件下采用3种不同的方法,即QB/T 1803—1993测定法、3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)、Phadebas amylase test法检测中温α-淀粉酶活力,分析用于检测中温α-淀粉酶活力快捷、方便、准确的方法,从而为其广泛的应用及测定提供依据。结果表明,QB/T 1803—1993测定法准确性高、精密度好,且操作简便、测定快捷,适于测定中温α-淀粉酶活力;3,5-二硝基水杨酸比色(DNS法)测得酶活力范围小,适于定性分析;同样的稀释度Phadebas amylase test法在37,60℃下的测定结果基本一致,而又由于中温α-淀粉酶的最适反应温度在60℃左右,说明该法不适于测定中温α-淀粉酶活力。     

芒果(Mangiferaindica)ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及生物信息学分析

以‘红玉’芒果采后96 h的果皮为材料,采用RT-PCR技术从芒果(Mangifera indica)果皮中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(ZDS),其c DNA全长为1 883 bp,具有1 710 bp的开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。对芒果ZDS蛋白的亲水/疏水性进行预测,发现芒果ZDS蛋白所含的氨基酸亲水/疏水性主要介于+2.5~-2.6之间。通过在线软件对其进行了定位预测及二级结构和三级结构进行了预测,发现ZDS定位在叶绿体中,ZDS基因编码的蛋白质有16个螺旋,13个折叠,通过系统进化树分析发现芒果中ZDS基因编码的蛋白与柚子、甜橙、蜜柑等植物的亲缘关系比较近。     

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆及生物信息学分析

为了解GM-CSF的基因及蛋白质特性,本研究以pUC-GM-CSF为模板,根据GenBank中登录的GM-CSF序列设计引物扩增GM-CSF基因,随后将其克隆至 pMD18-T载体,并对鉴定正确的重组质粒 pT-GM-CSF进行测序分析,然后对GM-CSF基因进行同源性分析、ORF分析、氨基酸序列分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二级结构预测。结果表明：该基因ORF的全部长度为453 bp,能够编码150个氨基酸,并且在GM-CSF基因所编码的蛋白质中有4个丝氨酸和3个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。同时,GM-CSF蛋白的最大疏水性为2.267,且有8.91%的可能位于细胞外,有0.8%的可能位于细胞壁,有0.24%的可能位于细胞质。同时,该蛋白质的二级结构主要由无规卷曲、α螺旋和延伸链构成。本研究通过对GM-CSF基因进行生物信息学分析,为探究其免疫增强机制奠定基础。     

蔗茅EfNAC基因的克隆和生物信息学分析

为了更好地利用甘蔗野生种蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)的抗逆相关基因,并为转基因甘蔗抗逆育种提供可靠的候选基因。本研究利用电子克隆和RT-PCR的方法在蔗茅野生种‘蔗茅99-2’中克隆到一个干旱诱导表达基因,并命名为FfNAC (GenBank登录号:MT499790)。生物信息学分析表明,FfNAC基因ORF长度为765 bp,共编码254个氨基酸,具有一个保守的NAM结构域。编码的蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,没有跨膜结构。本研究为深入研究蔗茅干旱胁迫的分子调控机制和转基因甘蔗抗旱育种提供理论依据和技术支撑。     

玉米ZmMAPKKK21基因的克隆和生物信息学分析

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）在植物应对生物和非生物胁迫过程中发挥着重要作用。在前期研究中我们挖掘到ZmMAPKKK21这一潜在的重要抗旱基因,本研究从玉米抗旱自交系J24中克隆获得ZmMAPKKK21基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,玉米ZmMAPKKK21基因开放阅读框长1419 bp,编码472个氨基酸,是不具有信号肽的亲水性蛋白,且其启动子序列含有多个与逆境胁迫和激素有关的顺式作用元件;玉米中的MAPKKK21蛋白预测定位在细胞核上,蛋白互作预测结果显示,ZmMAPKKK21蛋白与参与植物逆境胁迫相关的MAPKK3蛋白和ZIM家族蛋白发生互作,其结构与高粱（Sorghum bicolor L.）和谷子（Setaria italica L.）等高抗旱禾本科作物相比,不但在STKc＿MAPKKK结构域上高度保守,且具有更加相似的二级结构和三级结构;qRT-PCR分析发现,ZmMAPKKK21基因在玉米根系中表达水平较高,干旱胁迫后该基因在根和叶中表达上调,进一步验证了ZmMAPKKK21基因的表达与干旱胁迫响...     

乙酰乳酸合成酶基因(budB)整合表达载体的构建

为了进一步了解2,3-丁二醇合成路径中关键酶的表达量与产量之间的关系,本研究根据Gen Bank中乙酰乳酸合成酶基因(bud B)的基因序列设计引物,以产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HD79基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到目标酶基因,目的片段全长1680 bp。以表达载体p RSFDuet-1为骨架,利用基因工程手段构建整合表达载体p R1SW-bud B。电转化法将其转化至菌株HD79感受态细胞中,通过高浓度Kan筛选和PCR双重鉴定验证后测定ALS酶活力。结果表明,乙酰乳酸合成酶基因整合表达载体构建成功,酶活可达1.0627 U/mg,比原始菌株提高了4.35倍。在一定程度上为实现2,3-丁二醇的工业化生产奠定基础。     

甜樱桃(Prunus avium)PaGAST基因的电子克隆及生物信息学分析

为获得甜樱桃PaGAST 基因的cDNA 序列,并预测该基因编码蛋白的结构与功能,以草莓FaGAST1 基因序列为探针,通过基于NCBI数据库中表达序列标签的电子克隆技术对甜樱桃PaGAST 基 因进行克隆。利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、疏水性和亲水性、信号肽序列、跨膜结构域、亚细胞定位及功能等方面进行分析。结果表明：甜樱桃PaGAST 基因长度为750 bp,开放阅读框长度为324 bp,编码107 个氨基酸,N末端存在信号肽序列,C末端含有保守的GASA结构域。由于PaGAST蛋白中含有的疏水性氨基酸残基较多,该蛋白具有跨膜螺旋区,是一种跨膜蛋白,且有10 个预测的蛋白激酶磷酸化位点。亚细胞定位分析表明,PaGAST蛋白分布在细胞膜外的可能性很大。功能预测显示,PaGAST 基因可能具有响应胁迫应答、信号转导和免疫应答方面的功能。进化分析显示甜樱桃PaGAST蛋白与桃的亲缘关系最近。在一定程度上为甜樱桃PaGAST 基因的克隆及功能鉴定奠定理论基础。     

砂藓(Racomitrium canescens)RcRab基因的克隆及生物信息学分析

本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱处理转录组数据库中筛选获得小G结合蛋白基因Rab的mRNA序列,通过RT-PCR法扩增,得到RcRab基因的CDS序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该基因c DNA全长为1171 bp,包含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。预测该基因有Rab家族的保守结构域-G结构域。RcRab蛋白分子质量为23.29 kD,理论等电点为5.76,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。进化树分析表明,RcRab蛋白质与小立碗藓(Physcomitrella patens)Rab蛋白质亲缘关系最近。本研究可为进一步探索RcRab基因在苔藓植物中的抗旱机制提供数据基础。     

木薯(Manihot esculenta)AKT1基因的克隆及生物信息学分析

植物细胞中的K^+通道蛋白AKT1(Arabidopsis K^+transpoter 1)主要负责吸收K^+。本研究基于木薯基因组数据库信息,利用PCR技术从木薯中克隆一个MeAKT1基因,该基因全长2634 bp,编码877个氨基酸,生物信息学分析表明MeAKT1含有10个外显子和9个内含子,编码的氨基酸分子量为99.02 kD,等电点为8.43,属于稳定蛋白。MeAKT1包含有5个跨膜区域,N端含有1个Ion_trans结构域,C端有1个KHA结构域,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,进化树分析发现MeAKT1与蓖麻RcAKT1的亲缘关系最近。通过对MeAKT1蛋白的生物信息学分析有助于下一步深入研究MeAKT1在木薯耐贫瘠过程中的功能。     

甘薯果糖-1,6-二磷酸醛缩酶5基因(IbFBA5)的克隆与生物信息学分析

本研究利用甘薯徐薯18和徐781转录组测序结果,筛选到一条与淀粉合成相关的差异表达Unigene,编号为T1-30656。以徐781为材料,克隆该片段,并对其进行重测序和生物信息学分析。结果表明,该片段为果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的c DNA序列,该基因包含3个外显子和2个内含子,亚细胞定位在细胞质当中,将其命名为Ib FBA5。该c DNA长为1 341 bp,含1 074 bp的开放阅读框,编码357个氨基酸。其序列与番茄、油菜、粳稻和拟南芥等相似性在77%~79%之间。     

明日叶二氢黄酮醇4-还原酶(AkDFR)基因的克隆及生物信息学分析

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因是类黄酮合成途径的关键酶之一,在植物花色形成和黄酮物质合成中起着重要的作用。根据明日叶转录组测序得到的序列设计引物,以明日叶叶片cDNA为模板,通过RT-PCR方法克隆得到明日叶DFR基因的完整序列,并对其进行生物信息学和组织特异性分析。结果表明明日叶的AkDFR基因开放阅读框(ORF)有1 131 bp,编码376个氨基酸,蛋白大小为42.42 kD,等电点为5.83。用DNAman同源序列比对结果表明,明日叶的AkDFR基因与胡萝卜、杜鹃的DFR基因同源性均在80%以上。生物信息学分析AkDFR基因没有信号肽和跨膜区域,亲水系数为负数,可能为亲水蛋白。α-螺旋和无规则卷曲是DFR的主要二级结构元件。AkDFR基因在明日叶的不同组织中均有表达,其中叶片中的表达量最高。明日叶AkDFR基因的克隆及其生物信息学分析将为提高明日叶黄酮类化合物提供理论依据。     

彩色马铃薯二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的克隆及生物信息学分析

花色素苷是影响花色的主要色素,二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因是花色素苷合成的关键酶基因.本研究以云南地方彩色马铃薯品种‘剑川红’和‘转心乌’,外引品种‘黑美人’为实验材料,通过RT-PCR方法从其块茎表皮中克隆到DFR基因的完整cDNA序列,并进行了生物信息学分析.分析结果显示供试的三个彩色马铃薯的DFR基因编码3...     

一个玉米氯离子通道基因(clc)的电子克隆及生物信息学分析

氯离子通道植物生理代谢中起着重要的角色.通过电子克隆的方法获得玉米氯离子通道的cDNA全长序列.发现该基因包括5个外显子和4个内含子,并对其表达产物进行生物信息学分析,其表达产物与拟南芥ATCLC-A,ATCLC-B具有较高的相似性.     

玉米寡肽转运蛋白基因(ZmOPT0212)的克隆及其生物信息学分析

根据玉米B73和水稻的寡肽转运蛋白全长序列设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法从玉米自交系478中克隆到了寡肽转运蛋白基因,命名为ZmOPT0212(Accession number:HM021150).ZmOPT0212开放阅读框为2 151 bp,编码716个氨基酸残基,等电点8.87,相对分子质量为77.4 ...     

春兰DUF3598家族CgDUF1基因的克隆与生物信息学分析

DUF3598是一类具有未知功能结构域的基因家族,在植物的生长发育和响应逆境胁迫中可能扮演重要角色,为了研究DUF3598蛋白对春兰的调控作用,初步探讨其生物学功能,本试验以春兰为实验材料,采用RT-PCR的方法,克隆获得一段长为1 245 bp的ORF序列,暂命名为CgDUF1,并进行生物信息学预测分析。结果表明,CgDUF1基因共编码20种氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,属于非分泌性的亲水蛋白,预测该蛋白主要定位于叶绿体中。系统发育分析表明,CgDUF1蛋白与拟南芥DUF3598蛋白：A0A384KT89的亲缘关系最近。高级结构预测表明CgDUF1蛋白由3种二级结构组成,其中无规则卷曲占比最高,为54.59%。本研究为春兰DUF3598基因家族的生物学功能的研究提供了依据。     

转枯草芽孢杆菌纤溶酶基因对烟草氧自由基和保护酶系统的影响

除个别时期外,转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme,BSFE)基因及其信号肽和前肽序列烟草叶、茎、根氧自由基含量、超氧化物歧化酶活性均显著高于野生型烟草植株,抗坏血酸过氧化物酶活性也较野生型烟草植株高,但二者差异不显著。推测氧自由基含量的变化与BSFE的蛋白水解活性有关;超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶活性变化可能与该转基因烟草植株对外源BSFE基因表达和产物累积产生的逆境适应有关。     

芍药分生组织决定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息学分析

花分生组织决定基因APETALA2(AP2)属于植物ABCDE模型基因,在花器官发育过程中起着重要的调控作用。为进一步了解芍药AP2基因的生物学功能,利用RACE扩增和测序技术克隆plAP2基因序列,利用生物信息学在线程序对其序列特征、蛋白结构及功能、亚细胞定位进行预测,并利用MEGA 5.0构建不同植物AP2分子进化树,最后利用qPCR检测其在内外花瓣中的差异表达情况。结果显示,克隆获得芍药AP2基因(plAP2)cDNA序列全长1 935 bp,其ORF全长为1 578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,plAP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,表明为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS);二级结构包括α-螺旋(24%)、β-折叠(19%)、β-转角(28%)和无规则卷曲(28%);plAP2蛋白存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,plAP2蛋白包含2个相同的保守结构域:AP2/(Ethylene-Responsive factors,ERF)(151-213aa和243-306aa)。亚细胞定位主要在细胞质(45.0%)中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药AP2基因与牡丹高度同源且亲缘关系最近;qPCR检测显示外瓣AP2表达量均极显著高于内瓣(P0.01)。克隆出芍药AP2全长cDNA序列,系统地揭示了plAP2蛋白基本结构、功能位点区域、细胞定位以及组织表达情况,为今后深入研究plAP2基因功能提供基础素材和理论参考。