牙鲆GH基因的SNPs与生长性状关系的初步研究

以雌核发育牙鲆(Paralichthys olivaceus)为对象,根据Gen Bank收录的牙鲆生长激素基因序列(Gen Bank登录号:D29737)设计9对引物,采用直接测序的方法对50尾雌核发育牙鲆生长激素基因编码区和启动子进行了单核苷酸多态位点(SNPs)筛选,共获得有效序列1 838 bp,启动子区117 bp,内含子区1 050 bp,外显子区671 bp,覆盖牙鲆生长激素基因78.3%的序列。共检测到7个SNPs,平均发生频率为0.38/100个碱基,其中颠换型3个,插入型2个,缺失型2个;内含子区4个(Intron I:C477T、1 091~1 092/insert T、1 129~1 130/insert A;Intron IV:1 906A/-del),外显子区3个(Exon V:2067T/-del、A2006C、A1974G);SNPs与生长性状相关分析结果显示:C477T和2 067T/-del两个位点对牙鲆的体重、体长、体高等生长性状均有显著影响(P0.05),其他5个SNPs对牙鲆生长性状均无显著影响(P0.05)。研究结果可为牙鲆生长性状的SNPs标记辅助选育提供基础数据。     

刀鲚MSTN基因遗传多态性与生长性状的关联分析

为筛选刀鲚(Coilia ectenes)生长性状遗传改良的分子遗传标记,基于现有刀鲚转录组数据,利用基因克隆技术获得养殖刀鲚肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的全长序列,采用PCR产物直接测序和SNaPshot技术分别进行基因多态性的筛选和分型,并将不同基因型与刀鲚的生长性状(体长、体高和体质量)进行关联分析。结果显示,养殖刀鲚MSTN基因的DNA序列主要由2个内含子和3个外显子组成,经SNP位点筛选,仅在第1内含子上筛选到2个颠换突变位点(g.564G>T和g.755G>T)和1个转换突变位点(g.786C>T);将3个SNP位点与生长性状进行关联分析发现,SNP位点g.786C>T与刀鲚的体长、体高和体质量呈显著性负相关,具有TT基因型个体的体长、体高和体质量显著低于CC型和CT型(P<0.05),而SNP位点g.564G>T和g.755G>T的不同基因型仅与刀鲚的体高具有一定程度的相关性;3个SNP位点对养殖刀鲚的群体遗传分析显示,刀鲚养殖群体的观测杂合度(H O)、期望杂合度(H E)和多态信息含量(PIC)分别为0.280~0.480、0.332~0.455和0.277~0.351,3个SNP位点均属于中度多态(0.25T有望作为剔除劣质刀鲚繁育亲本的候选分子标记。     

草鱼PRL基因多态性与幼鱼生长性状和肌肉成分的关联分析

为了探索草鱼(Ctenopharyngodon idella)PRL(prolactin)基因多态性与草鱼生长性状和肌肉成分的关联性,通过测序法从10尾草鱼的PRL基因中筛选到6个突变率高于30%的变异位点,包括5个单核苷酸变异位点和1个插入型突变(–/CACTCACTA),分别命名为2551GA、2639GC、3247AG、5197TG、5897GA和3391–+。利用AS-PCR(allele-specific PCR)和基因分型技术对192尾4月龄草鱼的PRL基因变异位点进行检测;基于一般线性模型对变异位点多态性与草鱼生长性状和肌肉成分进行相关性分析。研究发现,2639GC、3391–+和5197TG对体长和体重具有显著影响(P0.05),2639GC对肌肉粗蛋白含量具有显著影响(P0.05)。单个位点基因型比较发现,3391–+的突变型(–+和++)个体的体长和体重均显著高于野生型(––)个体(P0.05);2639GC的GC及5197TG的突变型(TG和GG)个体的体长和体重分别显著低于2639GC的GG和5197TG的TT野生型(P0.05);2639GC突变型(CC)个体的粗蛋白含量显著高于2639GC其他基因型(GG和GC)个体(P0.05)。两位点组合比较发现,含3391–+突变型(–+和++)的组合对应体长和体重普遍高于其他组,含2639GC的CC突变型的组合对应粗脂肪含量和粗蛋白含量普遍较高,其中粗蛋白含量显著高于其他组(P0.05)。研究表明,草鱼PRL基因多态性与草鱼生长性状和肌肉成分间存在显著关联,推测相关变异位点可作为草鱼生长和肉质改良的候选辅助标记。     

大口黑鲈肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性位点的筛选及其与生长性状关联性分析

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术对大口黑鲈肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全序列进行了SNPs位点筛选和分型,共筛选到2个单核苷酸多态性(SNPs)位点(C-1453T和T+33C),其中C-1453T位于启动子E8 box和Octamer(＋)调控元件之间的区域,T+33C的突变位于第一外显子区域,属于同义突变,氨基酸没有发生变化;利用一般线性模型分析单标记位点与大口黑鲈生长性状(体重、体长、体高、体宽和眼间距)相关性,均未达到显著水平(P>0.05)。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,双倍型D2在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均高于其它双倍型,而双倍型D5在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均低于其它双倍型,双倍型D2与D5之间在5个主要生长性状均存在差异显著(P＜0.05),推测双倍型D2对生长性状起正相关,而双倍型D5与大口黑鲈的生长性状呈负相关,因此推断MSTN基因突变位点双倍型D2与D5可作为大口黑鲈生长性状的两个标记位点,用其分子标记位点来辅助大口黑鲈育种工作以期加快育种进程。     

甘肃金鳟生长激素基因多态性与生长性状的相关分析

生长激素（ GH）基因能够影响动物的生长,是一个与生长性状有关的基因。以315尾甘肃金鳟（ Oncorhyn-chus mykiss）为研究材料,分析了GH基因外显子区域多态性,并对基因型与生长性状进行了关联性分析。 PCR-SSCP分析结果显示B等位基因在外显子2区域第903 bp处发生G/C突变,存在3种基因型AA、 AB和BB。 D等位基因在外显子5区域第3049 bp处发生T/G的突变,在3094 bp处发生C/A的突变,其中第3049 bp处发生的T/G的突变导致第157位氨基酸由组氨酸变为谷氨酰胺,为有义突变,共检测到3种基因型CC、 CD和DD个体。最小二乘法分析表明, BB基因型的全长值和体长值都显著高于AA和AB基因型（ P＜0.05）。 T3049 G和C3094 A突变点对全长、体长和体重均有显著性影响（ P＜0.05）,其中CC基因型的全长值、体长值和体重值都高于DD和CD基因型。在标记辅助育种中,这些分子标记可以为甘肃金鳟遗传改良提供基础的数据和参考。     

大口黑鲈肌球蛋白重链基因SNPs的筛选及与生长性状的关联

肌球蛋白是肌肉细胞的重要组成成分,影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了研究肌球蛋白重链(MYH)基因多态性与大口黑鲈生长性状的相关性,本研究采用PCR技术扩增得到编码区序列全长为9759 bp的大口黑鲈MYH基因,该基因包含37个外显子和36个内含子,编码1940个氨基酸。采用直接测序法在MYH基因上筛选到8个单核苷酸多态性标记(SNP)位点(A-305G、G-558C、A-2784C、A-2816G、T-4765A、C-6206T、C-6811T和G-6935T),有4个位于外显子上,其中2个属于同义突变。用SNa Pshot方法对从同批繁殖、同塘养殖的大口黑鲈"优鲈1号"群体中随机选取的430尾个体中各位点的基因型进行检测。结果显示,内含子上的A-2784C和A-2816G位点完全连锁,所有位点在大口黑鲈"优鲈1号"群体中的平均有效等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为1.635、0.406和0.373,仅C-6206T、C-6811T和T-4765A位点的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg定律。采用一般线性模型分析各位点与大口黑鲈生长性状之间的相关性,研究发现,C-6811T位点CC基因型个体的体质量和全长显著大于TT基因型,CC基因型个体的体高和尾柄长显著大于CT和TT基因型,其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异。C-6811T位点与生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种的候选标记。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变。存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709。统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05)。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变.存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709.统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05).     

草鱼MSTN-1基因多态性及与早期生长性状和肌肉成分关联分析

为研究草鱼MSTN-1基因多态性及与早期生长性状和肌肉成分的相关性,本研究扩增出全长为3824 bp的草鱼MSTN-1基因,用长江选育草鱼群体对MSTN-1基因多态性进行筛选和验证。结果共发现3个多态性位点(Locus 1:C1799T,野生型EE/突变型EF;Locus2:C1842T,野生型HH/突变型HI;Locus 3:TGAAGCGCTGGTTCT/2585-,野生型BB/缺失型BD)。利用一般线性模型分析3个位点及其组合型(剔除个体数少于3的组合)与生长性状和肌肉成分的相关性,发现2个位点对幼鱼生长性状表型差异有显著影响,但3个位点对肌肉成分差异均无显著影响。多重比较发现,单倍型HI突变组的体长和体质量显著高于HH野生组,BD突变组的体长和体质量显著性低于BB野生组;多倍型中存在HI突变组合的体长、体质量均显著高于其他组,存在BD突变的组合在体长性状方面显著低于其他组。表明草鱼MSTN-1基因3个SNPs中,HI突变是对草鱼生长性状的有利突变,BD突变是不利突变,而EF突变无显著影响,可将MSTN-1基因作为分子标记辅助草鱼选育的候选基因。     

牙鲆选育家系生长性状的因子分析

记录了2009年建立的12个牙鲆家系240日龄个体的体质量、全长、体长、头长、躯干长、吻长、尾柄长、尾长、体高,和尾柄高等10个生长性状,对这12个家系的生长性状进行了因子分析。结果表明：第一至第四公因子对变异的方差贡献率分别为81．36％、10．12％、5．3％,和1．31％,累积贡献率达98．1％,表明这4个公因子很好地反映了所控制的10个生长性状及其相互作用关系。贡献率最高的第一公因子包含了大多数生长性状,其因子得分排序在前两位的家系为F11和F4,与这2个家系生长性状表型值排序相一致,表明这两个家系具有结构较好的生长构成性状和较高的性状表型值,可作为培育快速生长型牙鲆新品种的候选家系,进行生产验证和推广养殖。     

牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因.经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸.5'侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3'侧翼区含有加尾信号.通过同源分析,牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支.RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控.     

牙鲆骨骼生长性状与微卫星标记的相关性分析

利用106对牙鲆微卫星标记,对62尾双单倍体牙鲆的基因组DNA进行检测;用X射线检测仪对其骨骼进行成像,以骨骼图片测量体高和体长;用SPSS 13.0软件对双单倍体牙鲆的体质量、体长、体高进行相关分析和回归分析;用最小二乘法对微卫星标记与体质量、体长、体高作相关性分析。结果获得17个与体质量、体长、体高显著相关的标记,其中,Poli162TUF与体质量、体长、体高显著相关(P0.05);Poli72HFSM、Poli106TUF与体质量、体高显著相关(P0.05);Poli2023TUF、Poli1013TUF与体长、体高显著相关(P0.05);Po-li2042TUF、Poli1980TUF、Poli2045TUF、Poli2039TUF、Poli34TUF、PoGT17、HLJYP45、HLJYP81与体长显著相关(P0.05);Poli102TUF、Poli136TUF、Poli62MHFS、6-G3与体高显著相关(P0.05)。这些标记反映了牙鲆的生长优势性状,可作为辅助育种的参考标记。     

ENU诱变草鱼家系生长特性及肌肉生长抑制素基因SNP筛选的研究

经过175 d养殖,对4个N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变草鱼家系进行生长对比,采用显著性比较,偏相关分析和因子分析统计方法对草鱼体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析,进而运用双向测序法对MSTN1、MSTN2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示,家系4的生长速度明显大于家系3,家系4的8个性状明显大于其他3个家系;家系1中体长、尾柄长、体厚与体质量密切相关,家系2中体长、头长、体厚与体质量密切相关,家系3中全长、体长、尾柄高与体质量密切相关,家系4中全长、体长、体厚与体质量密切相关。由此可知,家系4和家系3具有明显的生长差异。对于MSTN1基因,家系3在465位点C/G、467位点G/A,家系4在465位点C/G均发生错义突变;对于MSTN2基因,家系3和4在912位点C/T均发生同义突变,家系3在1027位点G/A、家系4在366位点A/G均产生错义突变,位于非编码区1390位点A/T和1401位点G/A在两个家系均发现SNP位点。试验结果表明,MSTN1、MSTN2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼的生长性状存在紧密联系。     

草鱼D-loop多态性与幼苗生长性状的关联分析

为了探索草鱼(Ctenopharyngodon idella)线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)多态性对生长性状的影响,鉴于mt DNA的母性遗传特征,本研究基于2011年繁殖用的20尾母本的D-loop序列信息,与通过亲子鉴定获得的853尾40日龄子代的体长、体质量进行关联分析。结果显示,草鱼6种D-loop单倍型对生长性状表型差异具有极显著影响(P0.01);其中,单倍型为Hap16的子代的体长最大,并显著大于单倍型为Hap4的子代的体长(P0.05);单倍型为Hap18和Hap16的子代的体质量较大,依次大于其他单倍型子代的体质量,并显著大于单倍型为Hap4的子代的体质量(P0.05)。此外,草鱼D-loop序列各变异位点基因型对生长性状的影响水平不同;其中,Site01、Site06和Site07等3个位点对体长的差异存在显著影响(P0.05),Site06和Site07等2个位点对体质量的差异存在显著影响(P0.05)。研究表明,草鱼D-loop序列变异对子代生长性状具有显著影响,推测在草鱼生长性状改良的选育进程中,可以利用mt DNA多态性信息进行辅助选择。     

牙鲆体质量与形态性状的异速生长分析

为分析牙鲆（Paralichthys olivaceus）体质量与形态性状之间异速生长的遗传规律,通过人工受精的方法建立牙鲆19个全同胞家系,测量了牙鲆不同日龄的体质量和形态性状。采用逐步回归方法建立最优联合异速生长模型,将此模型镶嵌到体质量动物模型的每个遗传和环境效应中,进一步分析对多个形态性状异速生长遗传规律。静态异速生长分析表明：体质量与全长之间存在最大异速生长指数（1.415 5）,表现为正异速生长,剩余形态性状与体质量之间的异速生长指数为0.061 5~0.718 0,皆表现为负异速生长。全长与尾柄高之间异速生长指数的正遗传相关最大（0.907 8）;全长与尾柄长之间的负遗传相关最大（0.946 8）。不同模型通过统计标准比较,确定模型Ⅰ为进行牙鲆动态异速生长分析的最优随机回归模型。     

牙鲆遗传作图及生长性状QTL定位

采用牙鲆日本群体和韩国群体杂交的92个F₁个体作为分离群体, 利用微卫星标记和Joinmap 4.0作图软件构建了牙鲆遗传连锁图谱。共有221个SSR标记用于连锁图谱构建, 雌性图谱中, 共178个微卫星标记定位到22个连锁群上, 观测总长度为(G _oa )599.0 cM, 覆盖率(C _oa )达76.27%。雄性图谱中, 共194个微卫星标记定位到23个连锁群上, G _oa 为693.4 cM, C _oa 为78.82%。对全长、体质量、体高3组数据进行主成分分析处理, 得到可解释3个性状的89.6%特征的一组数据, 命名为牙鲆生长性状GT。用WinQTLCart 2.5软件的复合区间作图,在已构建的遗传连锁图谱上对牙鲆生长性状GT进行QTL定位, 取LOD经验值2.5为QTL存在的阈值; 对微卫星标记进行性状—标记之间的回归分析。本研究共定位3个与牙鲆生长性状GT相关的QTLs, qGT-f4 qGT-m20 qGT-f20,可解释表型变异率分别为27.60%, 13.74%, 10.27%。在性状—标记之间的回归分析中, 得到22个与生长性状GT相关(P<0.05)的微卫星标记, 单个标记可解释表型变异率介于3.70%~10.42%, 其中6个微卫星标记scaffold558_51720、scaffold558_26183、scaffold903_69232、scaffold485_47120 、scaffold1262_77386、scaffold809_65154与生长性状GT之间呈极显著相关(P><0.01), 可解释表型变异率分别为10.42%、7.31%、10.07%、10.07%、8.39%和11.26%。     

利用RNA-Seq技术分析草鱼生长性状相关基因和SNP标记

为开发与草鱼生长性状相关基因及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,实验采用转录组测序技术(RNA sequencing,RNA-Seq)对草鱼快长组和慢长组的肝脏、肌肉和脑组织分别进行分析,共获得31 465万条高质量短读序(clean reads),经组装得到34 147条拼接基因(unigene),平均长度为1 060 bp,其中有30 751条unigene获得注释。在肝脏、肌肉和脑组织中分别筛选到1 013、552和372个差异表达基因,并从中检测到4 580个SNP标记。采用SNaPshot技术对其中34个SNP标记在300尾草鱼生长性状极端群体中进行多态性检测和验证,30个SNP标记分型成功,准确率为88.24%。进一步采用一般线性模型分析30个SNP标记与生长性状的相关性,结果显示,unigene00810126-8014标记CC基因型的体质量、体长、体高、头长和尾柄长性状均值显著高于TT基因型。unigene00810126-2903标记AA基因型的体质量显著高于GG基因型。unigene00870394-525标...     

大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及其与生长性状关联分析

在动物体内组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)是以酶原形式存在于溶酶体中,能水解多种蛋白,是调控动物生长发育的重要候选功能基因。为开发与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究对大口黑鲈EST-SNP库中CTSB基因上的SNP位点进行筛选。经PCR扩增和测序分析,从该基因中筛选到1个SNP位点(命名为C+598G),该位点属于错义突变位点,编码的甘氨酸突变成为精氨酸。采用Sna Pshot方法对C+598G位点在165尾大口黑鲈养殖样本中的基因型进行检测,并分析其在群体中的遗传多样性。结果显示,C+598G位点在养殖群体中存在CC、GC和GG3种基因型,其频率分别是40.6%、47.3%和12.1%,C和G等位基因频率分别是64.2%和35.8%;该位点在群体中的观测杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)分别为0.473和0.354,符合哈代-温伯格平衡定律。进一步分析不同基因型与大口黑鲈生长性状相关性,结果表明,3种基因型个体的体质量、全长、体高、尾柄长和尾柄高性状平均值从小到大依次为GG型、GC型和CC型,其中GG型个体在体质量上显著小于CC型个体(P<0.05)。本研究获得的C+598G标记与大口黑鲈生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种研究中的生长标记。     

草鱼GH基因3'部分序列多态性与生长性状及肌肉成分的相关性分析

为了解草鱼GH基因多态性与早期生长性状及肌肉成分的相关性,实验利用直接测序法从156尾草鱼GH基因的3′部分序列中共筛选到9个变异位点(分别命名为SNP1~SNP9:G2825A、G2914T、T2966G、A3002T、T3022C、A3301G、C3463T、C3547T、C3620T)。卡方检验结果显示,9个位点均未显著偏离Hardy-Weinberg平衡,且均表现为中等多态性(0.25PIC0.5);经连锁不平衡分析发现,SNP3、SNP4和SNP5位点为一组完美连锁不平衡,SNP2、SNP7、SNP9位点为一组完美连锁不平衡;GH基因3′部分序列5个位点单倍型分析共发现6种单倍型,其中Hap1(30.4%)所占的比例最高,Hap6(4.8%)所占比例最低。利用GLM及多重比较对草鱼GH基因中9个SNPs多态性与早期生长性状和肌肉成分进行相关性分析,发现SNP2和SNP3位点的纯合突变型在体质量、体长和粗脂肪性状上均显著高于野生型和杂合突变型;在双倍型分析时得出了相似的结果,同时含有SNP2和SNP3位点纯合突变的双倍型组合在生长和粗脂肪性状上均显著性高于其他组合。研究表明,草鱼GH基因中SNP2和SNP3位点与早期生长性状及肌肉成分存在显著性相关,可作为草鱼生长及肉质改良的候选辅助分子标记,并且为进一步对相关变异位点的功能验证奠定研究基础。     

缢蛏EGFR基因内含子1内SNP位点多态性与生长性状相关性

为研究缢蛏表皮生长因子受体基因(epidermal growth factor receptor,EGFR)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与生长性状(壳长、壳宽、壳高和体质量)的相关性。本实验利用直接测序法从缢蛏EGFR基因的第一个内含子序列中共筛选到17个SNP位点。卡方检验结果显示,在17个位点中,有13个位点符合Hardy-Weinberg平衡,位点多态性检测显示17个位点中有10个位点表现为中等多态性(0.25PIC0.5)。利用一般线性模型(general linear model,GLM)及多重比较对缢蛏EGFR基因中17个SNPs的多态性与生长性状(壳长、壳宽、壳高和体质量)进行相关性分析,结果显示,16个SNP位点均与缢蛏的壳长、壳宽、壳高及体质量呈显著性相关。由此可见,EGFR基因可作为缢蛏生长性状改良的候选辅助分子标记,并且为进一步研究其生长相关功能奠定基础。