BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。     

牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一,具有细胞因子样功能,在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体,将M17基因插入pET-32a原核表达载体,构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,通过IPTG诱导M17蛋白表达,利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示,IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主;Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL^-1;多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16,经Western blotting分析可见单一目的条带,说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知,M17重组蛋白表达成功,且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。     

猴痘病毒E2L蛋白的表达、纯化及免疫原性评价

【目的】构建猴痘病毒E2L蛋白原核表达载体,经诱导表达及纯化鉴定后免疫接种昆明小鼠评价其免疫原性,为猴痘病毒诊断试剂、疫苗和特异性治疗药物的研发打下基础。【方法】根据GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列优化密码子后合成E2L基因,将其克隆至表达载体pET-28a（+）上构建原核表达载体pET-28a-E2L,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)受态细胞,采用控制变量的方法对融合蛋白最佳诱导表达条件进行优化,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。融合蛋白经His-Bind柱亲和层析纯化后,经腹腔注射免疫昆明小鼠,从免疫当天（第0 d）开始每隔7 d通过断尾法采集昆明小鼠血清1次,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】以构建的原核表达载体pET-28a-E2L转化BL21(DE3)受态细胞后,经IPTG诱导,能成功表达获得融合蛋白E2L,且主要以包涵体的形式进行表达。融合蛋白E2L的最佳诱导表达条件为40℃下以1.0 mmol/L IPTG诱导16 h,通过His-Bind柱亲和层析纯化时的最佳咪唑洗脱浓度为100 mmol/L。昆明小鼠免疫试验结果表明,纯化...     

PCV2 Cap蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型是一种常见的猪感染性病毒,Cap蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白,也是该病毒最主要的结构蛋白,是目前猪圆环病毒2型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了Cap蛋白原核表达质粒pET28a-His-Cap,转化Transetta(DE3)表达菌株,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及蛋白免疫印迹试验验证,重组蛋白主要以可溶性形式表达,少数为包涵体蛋白。以Ni-NTA树脂进行蛋白纯化,纯化后蛋白浓度为629μg·mL^-1,采用透析袋浓缩将重组蛋白浓缩,浓缩后蛋白终浓度为1.8 mg·mL^-1。将重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后制备抗原,免疫兔子采集全血,分离血清。经蛋白免疫印迹试验,该多抗与重组蛋白存在免疫反应性,ELISA检测抗体效价可达1∶32 000,IFA试验证明该多抗能够特异性识别猪圆环病毒2型。Cap蛋白多克隆抗体的成功制备,为后续猪圆环病毒2型基因工程疫苗制备过程中验证Cap体外蛋白表达提供了材料。     

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备

为制备猫传染性腹膜炎病毒N蛋白特异性多克隆抗体,研究根据HLJ/HRB/2016/11毒株N基因序列设计引物,通过PCR进行基因扩增,并将目的基因在Bam HⅠ、HindⅢ酶切位点克隆至pET32a(+)原核表达载体上,将其转化到BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度为1 mmol·L^-1的IPTG在16℃诱导16 h后,SDS-PAGE检测表达产物,结果显示,在约69 kda处出现目的条带,且该蛋白主要以可溶形式表达。将重组N蛋白经Ni柱纯化后,按每只BALB/c小鼠免疫50μg,三免后7 d采血分离血清,经间接ELSA检测结果显示,获得的N蛋白可被特异性识别且效价可达到1∶12 800。研究制备的猫传染性腹膜炎病毒N蛋白及其多克隆抗体为后续猫传染性腹膜炎的疫苗提供基础。     

马铃薯卷叶病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究克隆马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)衣壳蛋白(Coat Protein,CP)基因,改造其密码子,使其偏好原核表达,构建pCzn1-PLRV CP重组表达载体,通过大肠杆菌表达纯化,经Western Blot方法鉴定为PLRV CP蛋白,纯化后的蛋白免疫日本大耳兔,成功制备PLRV CP蛋白多克隆抗体,识别重组蛋白效价为128000倍,识别PLRV叶片的效价为32000倍,经Western Blot方法分析,其特异性良好.本研究为PLRV检测方法的建立及脱毒种薯的检测提供了必需的生物材料.     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

马铃薯M病毒衣壳蛋白原核表达和多克隆抗体制备

本研究利用RT-PCR技术从发病马铃薯植株叶片中克隆马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)的衣壳蛋白全长基因,该基因由912个碱基组成。将其亚克隆到表达载体pET-28b(+)中后,转化大肠杆菌菌株Rosetta。经IPTG诱导处理后,获得的重组蛋白大小约为33 kDa,与预期大小一致。经镍离子亲和层析纯化后免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体,免疫4次后多抗血清效价为1∶64 000。经ELISA和Western blot分析表明,多克隆抗体能够特异性的识别PVM。PVM多克隆抗体的制备为PVM快速检测方法的建立奠定了基础。     

SCMRP基因原核表达及多克隆抗体制备

SCMRP基因是根据大豆密码子偏向性,采用生物信息学方法对玉米胚乳蛋白基因(MRZP)进行改造并合成的新基因,是适合在大豆中高效表达的高含硫氨基酸基因,可用于豆科作物的品质改良。将新合成的SCMRP基因构建到含有6×His标签序列的原核表达载体pET-32b上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,SDS-PAGE和Western blot分析表明:经IPTG诱导,转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中能正常表达出约20ku的目标蛋白质,IPTG最佳诱导表达时间是6h,融合蛋白质以可溶组分形式存在。菌体总蛋白经金属鳌合层析纯化后免疫新西兰大耳兔,制备兔抗血清,经Western blot和琼脂板双向扩散试验表明,已纯化出SCMRP-6×His融合蛋白质,成功制备出SCMRP兔多克隆抗体,抗血清效价达到1:256。上述结果表明,新合成的SCMRP基因是能够在生物体中正常表达的完整基因,制备的SCMRP兔多克隆抗体可用于转SCMRP基因植物蛋白质表达分析。研究结果将为通过转基因技术改良豆科植物含硫氨基酸品质奠定重要基础。     

猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。     

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

斑马鱼SAA蛋白原核表达、抗体制备及菌结合试验

通过构建斑马鱼(Danio rerio)SAA原核表达载体,在大肠杆菌(E.coli)TB1中诱导表达并纯化获得了斑马鱼SAA融合蛋白,将纯化的斑马鱼SAA蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多克隆抗血清,并研究了斑马鱼SAA融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明,纯化的斑马鱼融合SAA蛋白能够与5种细菌直接结合,血清效价达到1∶2 000以上。     

拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC进行大肠杆菌原核表达和纯化,并免疫家兔,获得针对PAC蛋白的多克隆特异性抗体,为进一步研究PAC蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥PAC蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28a中,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PAC蛋白进行镍柱亲和纯化和SDS-PAGE割胶纯化,并将纯化的PAC蛋白通过皮下注射免疫家兔,利用分离得到的抗血清,针对拟南芥野生型、PAC敲除突变系pac-1和PAC过表达系PACOE的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因PAC的原核表达载体pET-28a-PAC,在37℃、1mmol/L IPTG诱导4h的大肠杆菌细胞中,可检测到分子质量为38.9ku的重组蛋白,其大部分以可溶形式存在。用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得PAC抗血清,该抗血清能够有效地检测出1ng原核表达的PAC重组蛋白,并在植物样品中检测出1条分子质量约为35ku的条带。【结论】成功制备了PAC蛋白的多克隆抗体,可用于植物中PAC蛋白含量的检测。     

小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

目的探讨小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备。方法采用特异性引物扩增小鼠B7-H4（mB7-H4）胞外功能区DNA,经酶切、拼接构建原核表达载体pET28a-mB7-H4。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21（DE3）菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果序列测定证实了构建的pET28a-mB7-H4重组表达载体含有mB7-H4编码序列,其序列分析与GenBank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量（Mr）为26.5 KD的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶12 800,Western blot分析显示抗体能特异性结合mB7-H4。结论成功制备了高表达重组mB7-H4蛋白的原核表达载体及高效价抗mB7-H4多克隆抗体,为进一步研究B7-H4的功能奠定了基础。     

ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备

将ShSAP1的阅读框连接到原核表达载体p ET32a(+)中,构建成ShSAP1原核表达载体PET-ShSAP1,然后将其转入宿主菌BL21,经IPTG诱导后,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白;将纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了ShSAP1的特异性抗血清;以融合蛋白作抗原,用间接ELISA法测定其抗血清效价为1∶25 000。     

猪c-Myc蛋白多克隆抗体的制备

【目的】克隆猪c-Myc基因CDS序列并构建其原核表达载体,同时纯化c-Myc蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体,为进一步研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep蛋白与宿主c-Myc蛋白之间的交互作用奠定基础。【方法】根据猪c-Myc全基因序列(GenBank No. NM＿001005154)设计引物,以反转录PCR方法扩增c-Myc基因CDS序列,经Nde I/Xho I双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+);转化至Arctic-Express^TM大肠杆菌后诱导表达;表达产物经变性、复性和His-Band Ni+层析柱亲和纯化后免疫新西兰白兔。抗原亲和层析法纯化抗体后,用间接ELISA法测定其效价,用Western blot检测其特异性。【结果】经检测,克隆产生的猪c-Myc基因CDS序列长度为1 359 bp,c-Myc-His重组蛋白主要以包涵体形式出现,分子质量约为63 kDa,由此蛋白制备的多抗效价可以达到1∶1 093 500,并能特异性识别猪c-Myc蛋白和重组蛋白c-Myc-His。【结论】...     

轮状病毒SA11株NSP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

构建轮状病毒SA11株NSP2蛋白原核表达质粒,纯化重组蛋白并制备多克隆抗体.根据GenBank中登录的轮状病毒SA11株NSP2基因组序列(LC178571.1)设计特异性引物,用PCR方法扩增并将其连接至pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET-28a-NSP2,转化至E.coli BL21(DE3)感受态...     

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

通过人工合成方法得到传染性造血器官坏死病毒(IHNV)糖蛋白(G蛋白)基因,将该基因克隆到表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a/IHNV-G,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plySs中。经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析表明,在1 mmol/L IPTG(诱导剂)、37℃条件下诱导4 h后,G蛋白在大肠杆菌中成功表达,得到了相对分子质量约为57 000的G蛋白。采用直接切胶免疫小鼠的方法制备多克隆抗体,ELISA分析结果显示,血清效价可达到1∶10 000。本试验中得到的G蛋白和多抗血清可为IHNV疫苗的研制以及胶体金试纸条快速检测方法的建立提供理论基础。