猪带绦虫45W基因家族cDNA克隆和序列分析

 根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到重要保护性抗原45W基因B型转录本cDNA,完整开放阅读框(ORF)的大小为459bp。序列同源性分析与比较表明,所获得的9个B型转录本cDNA除TSO45W-4B-1和TSO45W-4B-2与已报道的TSO45W-4B同源外,其余均属于首次报道的4     

猪带绦虫六钩蚴HSP的克隆和表达

提取猪带绦虫激活和未激活六钩蚴总RNA,RT-PCR扩增HSP目的基因,将目的基因与pGH克隆载体连接,经酶切鉴定后,将阳性重组质粒进行测序,结果扩增出激活的六钩蚴的目的片段。将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-28a-HSP中,并将获得的pET28a-HSP阳性重组子转化至宿主菌E.coliBL21,IPTG进行诱导表达,并对重组抗原pET-28a-HSP进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果表明重组经SDS-PAGE分析可见一条约35 kDa大小的融合蛋白条带的抗原,Western-blot结果显示其能被囊虫病人阳性血清识别。这将为进一步阐明六钩蚴入侵中间宿主的机理、设计新型抗猪囊虫病和绦虫病疫苗打下基础。     

猪带绦虫TSOL18-SP蛋白的原核表达及其多抗的制备

对TSOL18基因中4个碱基进行定点突变,并截去N端16个氨基酸的信号肽,构建pGEX-TSOL18-SP原核表达载体,IPTG诱导表达后进行产物的SDS-PAGE及Western blot分析;用改造的纯化蛋白免疫家兔后采集血清,经琼脂双扩散试验检测血清抗体效价.结果表明:TSOL18基因改造后长度为345 bp,共有7个碱基发生突变,但氨基酸序列没有改变,与GenBank收录的TSOL18基因核苷酸序列相似性为97%,氨基酸序列相似性为100%.SDS-PAGE及Western blot分析表明:改造的重组菌诱导后可高效表达可溶性目的蛋白,且TSOL18-SP分子量约为38.7 kD,与猪带绦虫六钩蚴阳性血清反应性强;琼脂双扩散法测定免疫兔血清抗体效价为1∶32~64,说明表达的TSOL18-SP蛋白具有较好的免疫原性.     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

猪带绦虫组织蛋白酶B基因的克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索猪带绦虫组织蛋白酶B基因克隆、原核表达及抗血清制备的方法。[方法]根据从Gene DB获得的猪带绦虫组织蛋白酶B的基因序列设计特异性引物,以猪带绦虫的c DNA为模板,扩增出猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框。将去掉信号肽的部分进行了原核表达,用重组蛋白免疫青紫蓝灰兔,并制备高效价抗血清。[结果]成功克隆了猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框序列,将其命名为Tscp B,长度为1 074 bp,编码357个氨基酸,理论蛋白分子质量约为39.71 ku,具有组织蛋白酶B的特征结构域。采用大肠杆菌原核表达系统对目的蛋白进行大量表达,成功获得了大小约38 ku的猪带绦虫组织蛋白酶B的重组蛋白,此目的蛋白以包涵体的形式存在。Western blotting表明,猪囊尾蚴病阳性血清可以与纯化的重组蛋白发生特异性结合,说明被猪囊尾蚴感染过的猪血清中存在组织蛋白酶B的抗体。[结论]猪带绦虫组织蛋白酶B重组质粒能在大肠杆菌系统中高效表达,且该蛋白具有较高的免疫活性。     

口蹄疫病毒3A、3B、3C基因克隆、表达及其抗体消长规律的研究

 成功克隆到O 型口蹄疫病毒（FMDV）太保毒株3ABC 基因片段中的3A、3B、3C基因，并将它们插入pGEX-4T-1 或24B11表达载体构建了重组表达质粒，经Western blotting 分析表明，表达的3A、3B蛋白可与FMDV阳性血清发生特异性反应，但表达的3C蛋白没有反应。以纯化的3A、3B表达蛋白为抗原建立间接ELISA，对4组背景清楚的试验牛血清进行检测，结果表明3A、3B表达蛋白与非免疫对照组（C组）和灭活疫苗反复免疫组（CI组）牛血清均不发生反应，与未免疫直接攻毒组（D组）和免疫后攻毒组（I组）牛血清均发生反应；D组和I组3A、3B表达蛋白抗体持续时间最长可达90 d以上，3A和3B表达蛋白最早检出相应抗体的时间分别为攻毒后第 5天和第10天。     

猪圆环病毒Ⅱ型衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达

将PCV2衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白在大肠杆菌中融合表达。利用PCR技术扩增猪圆环病毒Cap基因。将Cap基因克隆至T4噬菌体表达质粒pSOC的SOC基因（T4噬菌体表面非结构蛋白基因）下游,构建成T4噬菌体SOC位点表达Cap的表达载体pSOC-Cap。将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后表达的目的蛋白SOC-Cap进行SDS-PAGE与Western-blot方法检测。表达的SOC-Cap蛋白相对分子质量约28kD,表达量占菌体总蛋白量的22.31%,并具有与PCV2特异性抗体反应的活性。PCV2衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达后,表达量较高,并具有免疫活性,有望用于猪圆环病毒II型的诊断和预防。     

猪FAM213B基因mRNA和启动子的克隆及序列分析

【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。     

猪D型产毒素多杀性巴氏杆菌毒素分段基因的原核表达

根据GenBank已发表的产毒素多杀性巴氏杆菌（T＋Pm）toxA基因序列（AF240778）设计1对引物,从猪源D型T＋Pm中扩增出toxA基因片段（3858 bp）,再根据toxA基因序列设计3对引物,分别扩增出ZQ（1084 bp）、ZH（1092 bp）、HM（906 bp）3个分段基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,转入大肠杆菌BL21中进行融合表达。经SDS-PAGE和West-ern blotting检测分析,发现ZQ、HM基因的表达产物以包涵体形式存在,大小分别为75、50 kDa,ZH基因不表达。动物试验结果表明,HM重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性,而ZQ重组蛋白没有免疫原性、反应原性及生物学活性。通过间接ELISA的方法检测抗毒素的阳性猪血清,结果表明,HM重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性。     

用RT-qPCR方法评价4个不同猪品种骨骼肌候选内参基因

【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白（TBP）、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A (PPIA)、β-2微球蛋白（B2M）、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白（YWHAZ）、β-肌动蛋白（ACTB）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH） 8个候选内参基因，选取国外引进的长白、约克与杜洛克公猪，进行三元杂交生产的商品猪（DLY），长白、约克猪进行二元杂交的商品猪（LY），成华猪和藏猪共4个品种进行基因表达正常化评价。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper3种常用算法评估候选内参基因的稳定性。将3种常用算法的结果进行综合排名。【结果】8个候选内参基因在不同猪种中表现出较高的表达稳定性，但表达循环阈值不同。【结论】运用3种不同的评估算法可以筛选出相似的候选内参基因，该结果可为猪骨骼肌基因表达RT-qPCR分析内参基因的选择提供参考。     

非洲猪瘟病毒(Malawi LIL 20/1株)k8R基因的表达与鉴定

蛋白多肽二级结构的电脑预测表明,非洲猪瘟病毒（ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１株）ｋ８Ｒ基因编码带有多个疏水氨基酸小区的２７ｋＤａ蛋白质。该基因的ＰＣＲ产物克隆入质粒ｐＧＥＸ－２Ｔ后,在大肠杆菌中表达４２～５４ｋＤａ不溶性ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白。此表达蛋白能被针对不同非洲猪瘟病毒株的猪免疫血清识别。在非洲猪瘟病毒细胞适应株感染的细胞中,针对ｋ８Ｒ大肠杆菌表达产物的单抗能检测出２７ｋＤａ特异病毒蛋白。进一步鉴定表明,ｋ８Ｒ基因编码的蛋白质为病毒非结构蛋白,不发生糖基化,出现于病毒感染周期的晚期,主要集中于靠近细胞核的病毒复制部位。用大肠杆菌表达的ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白免疫猪未能抵抗ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１强毒株攻击。     

缩胆囊素主动免疫对猪生产性能的影响

[目的]利用分子生物学技术扩增猪CCK基因活性片段,检验主动免疫CCK融合蛋白对肉猪生长是否有促进作用。[方法]采用RT-PCR技术成功扩增猪缩胆囊素基因C-端活性片段,并在大肠杆菌中进行表达。[结果]主动免疫0.5和1.5mg/mlCCK疫苗处理组肉猪,试验期肉猪平均日增重较空白对照组分别提高5.81%和7.36%（P〈0.05）,采食量分别提高4.04%和2.53%。利用SDS-PAGE可获得相对分子质量45000的融合蛋白。融合蛋白主要以可溶形式表达。Wesrtern Blot证实融合蛋白与CCK-8阳性血清具有良好的免疫反应性。[结论]主动免疫CCK对肉猪生长具有一定促进作用。     

猪囊尾蚴dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dUTPase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dUTPase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dUTPase基因与六钩蚴的dUTPase基因核苷酸同源性为100%,而且其氨基酸序列中同样存在5个保守基序。SDS-PAGE显示在21kD附近出现与目的蛋白大小相符的特异条带,表达产物经纯化后dUTPase的含量为2.863mg·mL-1。酶学活性试验证实重组dUTPase能特异性降解dUTP,同时EDTA可以抑制dUTPase的活性;而Mg2+可以增强猪囊尾蚴dUTPase的活性。【结论】成功克隆表达了猪囊尾蚴dUTPase基因并鉴定了它的酶学活性,为进一步研究dUTPase在猪囊尾蚴中的生物学功能奠定了基础,同时也为抗猪囊尾蚴病的药物设计和开发提供了研究基础。     

FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析

根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.     

EIAV gp45和 HIV gp120基因在不同表达系统中表达效果比较

马传染性贫血病毒(EIAV)gp45基因编码跨膜蛋白TM,该蛋白在介导病毒与靶细胞之间的融膜过程中起关键作用。gpl20蛋白是人类免疫缺陷病毒(HIV)的外膜糖蛋白,是病毒的主要抗原。通过大肠杆菌原核表达系统和果蝇细胞真核表达系统分别表达gp45及gp120,并对其表达效果进行对比,结果表明: 在大肠杆菌表达系统中,gp45可成功表达,而gp120却不能表达。在真核表达系统中,gp120成功表达,而gp45却未能表达。通过对这两种系统表达情况效果的比较,发现gp45在原核系统中表达有利,而gp120在真核系统中表达有优势,表明这些基因的表达具有特异性,本研究指导我们根据特定的基因选用适当的表达系统,以便纯化所需的目的蛋白,同时也为深入研究HIV的包膜蛋白的生物学结构特性及推动相关疫苗的研究奠定基础。     

Development of a recombinant pB602L-based indirect ELISA assay for detecting antibodies against African swine fever virus in pigs

African swine fever(ASF), caused by the African swine fever virus(ASFV), is a devastating disease of domestic and wild pigs. There is no effective vaccine, and the control of the disease relies mainly on surveillance and early detection of infected pigs. Previously, serological assays, such as ELISA, have been developed mainly based on recombinant structural viral proteins of ASFV, including p72, p54, and p30. However, the antibodies against these proteins do not provide efficient protection aga...     

两个苹果乙烯反应因子MdAP2D4与MdAP2D19的序列分析及原核表达

【目的】克隆苹果中的两个ERF（ethylene responsive factor）转录因子,对其序列与表达进行分析;并进一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,为解析两基因的抗病功能及作用机制奠定基础。【方法】首先,将抑制性消减杂交筛选到的EST序列进行BLAST比对,根据比对获得的MdAP2D4与MdAP2D19的cDNA序列设计引物进行克隆;然后,利用MEGA4.1软件将两个ERF蛋白与拟南芥的AP2家族蛋白进行聚类分析,对保守的AP2功能域的氨基酸序列进行分析;并进一步利用RT-PCR检测两基因对外源MeJA的响应;最后,将两个基因分别连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21进行诱导。【结果】MdAP2D4与MdAP2D19两个基因均与拟南芥B3组ERF亲缘关系最近,在叶片中表达较高,都能被外源的MeJA诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,两个基因的融合蛋白均能够被IPTG诱导表达。【结论】 MdAP2D4与MdAP2D19为 B3组ERF转录因子,外源MeJA能够诱导其表达。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因在大肠杆菌中的表达及产物免疫活性检测

鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达。通过pMALTM融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA法检测其生物活性。结果表明,表达的重组核蛋门纯化后出现2条带,相对分子质量分别约为92和82 ku,与Western blot出现的2条蛋白带一致;纯化的重组蛋白经裂解因子作用后,出现2条蛋白带,相对分子质量分别为45和35 ku,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性略高于与其他毒株的反应性。以上结果表明,原核表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望作为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断。