沙棘根瘤内生菌株库构建与微生物多样性分析

  目的  沙棘Hippophae rhamnoides根瘤中拥有丰富的微生物资源，探究根瘤内生菌微生物多样性，比较高通量测序与纯培养方法的优劣。  方法  运用16S rRNA高通量测序技术探究沙棘根瘤内生菌相对丰度和多样性差异，并对根瘤内生菌进行分离纯培养，以完成内生菌株库初步构建。  结果  ①传统分离方法得到纯培养菌株96株，共4门8纲8目13科19属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes。②高通量测序分析6组样品(M1~M6)中共有14门34纲89目148科314属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为放线菌门Actinobacteria和变形菌门，两者相对丰度之和为87.50%~97.10%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。③高通量测序与纯培养方法的结果有明显差异，在科和属的分类单元上差异较大。  结论  2种方法都体现沙棘根瘤内生菌的多样性，但纯培养方法仅能够分离到部分内生菌，难以评估物种组成及相对丰度。高通量测序分析能够更为全面地反映多样性信息，且为优化纯培养条件而分离特定物种奠定基础。图3表3参41     

广西北海红树林土壤放线菌的分离与鉴定

[目的]鉴定广西北海红树林土壤放线菌的物种多样性。[方法]从广西北海红树林土壤中分离、筛选10株典型放线菌菌株,提取基因组DNA,进行16SrDNAPCR扩增与测序,并构建进化树。[结果]通过Blast比对,10株放线菌属于2个属,其中8株为链霉菌属（80%）,2株为拟诺卡氏菌属（20%）。[结论]广西北海红树林土壤蕴藏着种类丰富的放线菌。     

《中国学术期刊影响因子年报》系列数据库首发式的北京召开沙雅县胡杨林土壤可培养细菌的多样性分析

[目的]了解新疆沙雅县胡杨林土壤可培养细菌的多样性.[方法]沙雅县胡杨林采集土壤样品,采用两种不同的培养基(LB,TSA)分离纯化细菌,并对它们进行16S rDNA测定和系统进化分析.[结果]分离纯化不同表型的57株细菌.对它们16S rDNA序列分析表明,57株菌分别属于3个大类群厚壁菌门(Firmicutes),放线菌门(Actinobacteria),γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria),13个属,33个种;芽孢杆菌属是优势细菌种群,它占已测种群的67.2;.其中6株菌M28,M13,CT3,YS30-1,CM5,CL19初步被认为是潜在的新种(16S rDNA相似率为96.780;～97.961;).[结论]沙雅县胡杨林可培养细菌不仅具有比较高的多样性,并存在一些潜在的新的细菌菌种资源,极具进一步发掘的潜力.     

泡桐根瘤内生细菌的分离及初步鉴定

【目的】为了探究非豆科植物泡桐与微生物共生固氮体系,对泡桐根瘤内生细菌的分离培养条件 及其系统发育地位进行初步研究。【方法】对从广西钦州市采集的泡桐根瘤上分离纯化得到的根瘤内生细菌, 进行传统生理生化研究和 16S rDNA 系统发育分析。【结果】经分离纯化得到 9 株根瘤内生细菌,大部分菌株 能较好地利用 8 种碳源;78% 的菌株能利用铵盐,89% 的菌株能利用硝酸盐;所有的供试菌株在 3- 酮基乳糖 和淀粉水解试验中呈阴性;89% 的菌株能利用柠檬酸盐;B.T.B 反应除菌株 PG-7 产碱外,其余都产酸;33% 的菌株能使硝酸盐还原;有 56% 的菌株能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好,多数菌株具备豆科植物根瘤菌的 一般生理生化特征。通过 16S rDNA 全序列分析,确定 9 株供试菌株可分为 4 个菌属,其中菌株 PG-1 和 PG-2 共属于土壤杆菌属（Agrobacterium）,PG-3、PG-5、PG-6、PG-8 和 PG-9 等 5 株菌株共属于根瘤菌属（Rhizobium）, PG-4 隶属于草螺菌属（Herbaspirillum）,PG-7 隶属于伯克氏菌属（Burkholderia）。【结论】分离自同一寄主 的根瘤内生细菌其生理生化特性方面存在较大的差异性,同时表现出了遗传的多样性。     

沙枣、沙棘Frankia放线菌回接试验

<正> 沙枣、沙棘是新疆荒漠盐碱土上的先锋植物,具有抗寒、抗旱、防风固沙和耐盐碱的特性,同时也是新疆非豆科固氮树种。60年代超显微结构研究证实,非豆科树木根瘤内生菌是放线菌。自1986年以来,我们对南北疆沙枣沙棘根瘤内生菌—Frankia放线菌进行了分离纯化,共得到38株菌株,其中从小沙枣根瘤中分离得到15株,大沙枣20株,沙棘3株。为了证实这些放线菌是否确是沙枣沙棘根瘤内生菌—Frankia放线菌典型菌株,我们于1987—1988年作了回接试验,并从中筛选出抗逆性强、固氮能力较高的4株菌种。     

沙棘根瘤的解剖学研究

为了解沙棘根瘤的固氮能力，对其进行了形态结构和解剖结构的研究。结果表明：沙棘（Hippophae rhamnoides)的根系发达，具有很强的分蘖能力，而且能和放线菌中的弗兰克氏菌（Frankia)共生，形成根瘤。对根瘤生长、发育及形成的泡囊进行了研究，明确了根瘤的寄生部位和泡囊的固氮情况，并深入研究了Frankia菌的分离培养以及根瘤的侵染过程。     

25株植物内生放线菌的系统发育分析

[目的]初步确定25株植物内生放线菌的种属关系。[方法]采用改进的FRED法从小麦、大葱、油菜等植物中分离出的25株内生放线菌中提取基因组DNA,对其16S rDNA序列进行PCR扩增和测序,并对其进行系统发育分析。[结果]系统发育分析结果表明25株植物内生放线菌可分为5个属,其中1株糖霉菌属,2株拟诺卡氏菌属,7株诺卡氏菌属,10株小单孢菌属和5株链霉菌属。[结论]25株供试菌株中,小单孢菌属所占比例最高。供试内生放线菌与相应菌属中已知菌株之间的进化距离集中在97.39%~99.92%范围内。     

贵州地区土壤中需氧放线菌的分离鉴定

为了解贵州土壤需氧放线菌的分布特点、系统发育和物种多样性,采集贵州贵阳、遵义、安顺、铜仁、毕节、黔南、六盘水、黔东南、黔西南9个区域的农耕地、湿地、森林3个类型土壤标本进行需氧放线菌的分离纯化,扩增其16S rDNA 基因序列后在 GenBank 中进行 Blast 比对分析,并以邻接法构建系统发育树。结果表明：在贵州9个区域108份土壤中分离出173株需氧放线菌,其中链霉菌属（Streptomyces）165株、北里孢菌属（Kitasatospora．）5株、诺卡氏菌属（Nocardioides）2株,在遵义农耕地土壤中分离出链霉菌属潜在新种1株（GYM8-3）。贵州土壤需氧放线菌主要为链霉菌属,在种间水平上存在分类多样性和地域差异性。     

北海山口·大冠沙红树林放线菌的筛选与鉴定

[目的]了解广西北海山口、大冠沙红树林海泥中的放线菌资源。[方法]采用海水配制高氏培养基,分离来自广西北海红树林海洋淤泥中的放线菌样品,从中筛选、分离、提取10株典型放线菌菌株总DNA,用放线菌通用引物对16SrDNA进行PCR扩增,对扩增结果进行DNA序列测定。[结果]10株典型放线菌菌株中,8株（80%）是链霉菌属,为常见放线菌;2株（20%）是拟诺卡氏菌属,为稀有放线菌。[结论]广西北海红树林海洋淤泥蕴含着种类丰富的放线菌。     

一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析

[目的]对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础.[方法]对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLΠ-4)进行培养,提取其基因组DNA.设计16S rDNA通用引物,扩增16S rDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序.[结果]提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16S rDNA基因片段,长度为1528 bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16S rDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌.[结论]初步将高产脂肪酶细菌JTΠ-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌.     

大青山油松根际固氮菌的多样性研究

[目的]研究大青山油松树种根际固氮菌的多样性。[方法]对从大青山油松(Pinus tabulaeformis)根际土壤中分离的固氮菌进行16S rDNA扩增及序列测定,应用DNAMAN 6.0软件进行多序列比对,使用MEGA4软件构建系统发育树。[结果]大青山油松根际土壤中分离的46株固氮菌分属于Pseudomonas、Bacillus、Phyllobacterium、Cupriavidus、Paenibacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等11个不同的类群,其中Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium为优势属种。系统分析表明,大青山油松根际土壤中固氮菌具有较丰富的多样性。[结论]该研究结果可为森林生态系统的可持续发展提供理论依据。     

江南桤木等根瘤内生菌的分离和回接

从赤杨属(Aluns)江南桤木(Alnus traboculosa Hand)根瘤上分离到放线菌Frankia sp.F_3,从胡颓子属(Elaeagnus)厦门胡颓子(Elaeagnusoldhani Maxim)根瘤上分离到放线菌Frankia sp.FE4,蔓胡颓子(Eleaegnusglabra Thumb)根瘤上分离到放线菌Frankia sp.FE_3,均获得纯培养。 用光学显微镜和扫描电镜观察其形态特征,确认是属具有孢囊的放线菌。该菌慢生长型,在培养基内菌丝体发育好,无气生菌丝体。液体培养,在底部生长,属微好气性。孢囊形状不规则,囊内包着大量的不游动的孢囊孢子。菌丝分枝有隔,粗细不匀,革兰氏阳性。将分离菌F_3,FE_4,FE_3回接其宿主,感染结瘤,有固氮活性。     

铅锌矿区重金属污染对微生物数量及放线菌群落结构的影响

采集四川省汉源县富泉乡万顺铅锌矿区5个不同重金属浓度的土壤样品,进行了微生物数量及放线菌多样性的研究.经分离、纯化得到43株不同的放线菌,然后对其进行BOXAIR-PCR和16S rDNA PCR-RFLP分析.结果表明,铅锌矿区重金属复合污染对土壤微生物数量有较大的影响,随着铅锌矿区重金属污染程度的加剧,土壤微牛物的总数下降.相关性分析表明,重金属含量与细菌数量呈极显著负相关(P<0.01),与放线菌数量、真菌数量呈显著负相关(P<0.05).供试菌株的16S rDNA用Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Taq Ⅰ酶切后具有32种遗传图谱类型.BOXAIR-PCR的聚类结果表明在86%的水平上,所有菌株分为10个遗传类型,结果基本与16S rDNA PCR-RFLP聚类差异不大.来源于高重金属的含量样品的菌株基本聚在一起,可能是重金属含量影响了放线菌的分布.同时,16S rDNA序列聚类分析结合系统发育树分析表明链霉菌属是汉源铅锌矿区主要的放线菌属并且具有遗传多样性.     

嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因克隆及系统发育

[目的]确定嗜热蛋白酶生产菌DPE7的系统发育地位。[方法]通过PCR方法扩增出嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因片段,并对其进行了克隆和测序。[结果]对该序列在GenBank中的BLAST结果表明,相似性高于99%的序列中大部分是泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列,其中与Geobacillus toebii T1680的16 S rRNA基因序列相似性达99.60%。对菌株DPE7和其他13株泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列进行系统发育分析,菌株DPE7与其中的4株泥土芽胞杆菌聚类在一起。[结论]经16 S rRNA基因序列同源性比较和系统发育分析,确定菌株DPE7为泥土芽胞杆菌。     

中国北方地区甘草根瘤菌表型及遗传多样性研究

【目的】了解中国北方地区甘草根瘤菌的生物多样性。【方法】采用表型数值分类、16S rDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。【结果】供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16S rDNA PCR-RFLP分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。【结论】在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium属中均有分布。     

柠条与沙棘共生固氮菌资源特性对比分析

柠条与沙棘两种木本灌木均具有御旱与耐旱性,是山西省半干旱气候区的结瘤植物资源优势,其共生固氮菌Rhizobia与Frankia菌系在山西石灰性土壤中的生态分布广泛,结瘤特征明显,大约每年为该生态区提供10万~20万t的生物氮素,在山西的生态环境建设、水土保持与资源利用方面发挥着较大的生态学效应,具有深入研究和广泛的利用价值。     

宁夏沙棘共生Frankia菌多样性分析

利用PCR-RFLP分子标记技术,对宁夏固原7个样点210个沙棘根瘤样品进行沙棘共生Frankia菌多样性分析。研究结果表明,共扩增出22条可分析条带,其中多态性条带15条、占68.18%,所有样品可分为A～E 5个基因型,聚类分析可分为两大类。宁夏沙棘共生Frankia菌多样性丰富。基因型D和E出现在土壤贫瘠地区,可能是最早与沙棘共生的菌种。     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16Sr DNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。