Capsid Protein Genetic Analysis and Viral Spread to the Spinal Cord in Cats Experimentally Infected with Feline Calicivirus (FCV)

We investigated primitively the molecular basis of the neural spread of a feline calcivirus isolate (FCV-S) from the spinal cord of a cat that died after manifesting excitation. Experimental infections of cats with three clones from parent virus isolate FCV-S, isolated based on plaque size, were performed, and virus recovery from the spinal cord and the nucleotide and predicted amino acid sequences of the viral capsid protein region (ORF2) were compared. In the experimental infection with the one-time cloned virus (C1L1) isolated from a large plaque, the C1L1 was recovered from the spinal cord. In contrast, seven-times cloned C6L7 (from large plaque) and five-times cloned C5S2 (isolated from small plaque) were not recovered from the spinal cord. Genetic analysis of the capsid protein gene of the three viral clones revealed that four bases were different and two amino acids were different at positions 34 (Val in C6L7 and Ala in C1L1 and C5S2) and 46 (Leu in C6L7 and Pro in C1L1 and C5S2) between C6L7 (with large plaque) and C5S2 (with small plaque). The amino acid at position 434 of C1L1 was different from those of C6L7 and C5S2 (Gly in C1L1, D (Asp) in C6L7 and C5S2). From these results, the plaque size seemed not to be related to the spread of virus to the spinal cord. Clone C1L1, which spread to the spinal cord, had a difference of one amino acid from the other two clones, which may be related to the ability to spread to the spinal cord.     

Phylogenetic Analysis of Field Isolates of Feline Calcivirus (FCV) in Japan by Sequencing Part of Its Capsid Gene

The molecular epidemiology of the infectious disease caused by feline calcivirus (FCV) in Japan was investigated by analysing the phylogenetic relationship among 21 Japanese field isolates, including the F4 strain, and 30 global isolates. Parts of the capsid gene (B–F) of the isolates were amplified by RT-PCR, and the amino acid sequences were compared with those from the global isolates. Thirty-seven and 14 out of a total of 51 isolates were clustered into two distinct genogroups, I and II respectively, by UPGMA and NJ analysis. Seven of the 21 Japanese isolates (33%) fell into group I together with 30 global isolates, while the other 14 Japanese isolates (67%) belonged to group II. The bootstrap repetition analysis of groups I and II formed by the NJ method gave a value of 99.0%. The 14 latter Japanese isolates were clearly separated from the isolates in group I, and they were different from any previously known FCV, forming a new genogroup, which implies that this lineage has been confined to Japan. Comparing the amino acid sequences shared by groups I and II, the amino acid at position 377 in B region was asparagine (Asn or Asp (NH₂)) in group I, while it was lysine (Lys) in all the strains in group II. Similarly, the amino acid at position 539 in the F region was alanine (Ala) or proline (Pro) in group I, while it was valine (Val) in group II; glycine (Gly) at position 557 in group I was serine (Ser) in Group II; and phenylalanine (Phe) or leucine (Leu) at position 566 in genogroup I was tyrosine (Tyr) in group II.     

2017-2021年成都市猫细小病毒的检测及其VP2基因的变异分析

本研究旨在通过对成都地区家养猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的分子检测,了解FPV在成都地区的流行及遗传变异情况.2017-2021年分别从四川成都地区采集168份家养猫的腹泻粪便样本,用PCR方法对168份样本进行FPV检测,并选取13份阳性样本进行VP2基因全长的克隆和测序,用Meg Ali...     

兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析

应用RT-PCR方法从兔出血症病毒（RHDV）西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册（登录号为DQ530363）。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区（西北、华东、东北、西南）的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。     

用Reo、AIV及ILT病毒试验性污染鸡新城疫疫苗的检测

实验性的以呼肠孤病毒、禽流感病毒和传染性喉气管炎病毒分别污染ＮＤ（ＬａＳｏｔａ）疫苗，经特异性ＮＤ抗血清中和之后接种鸡胚。经血清中和未污染的疫苗对照鸡胚全部生存，所有死亡的被实验性污染病毒疫苗的鸡胚都按其污染的病毒出现其特有的病理变化。作者认为应用此种方法可以检出活疫苗中污染的外源病毒。     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性检测及耐药基因分析

为明确鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性及耐药基因的分布特征,试验采用琼脂二倍稀释法对分离自福建、广东和江西等地的89株鸭源多杀性巴氏杆菌进行甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐受性检测,用PCR法检测各耐药菌株的磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3),并利用多位点序列分型(MLST)分析耐药菌株间的亲缘关系。结果显示,33株鸭源多杀性巴氏杆菌对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐受,耐药率为37.1%(33/89);在耐药菌株中,sul1、sul2和sul3基因检出率分别为100%(33/33)、97.0%(32/33)和21.2%(7/33),其中sul1和sul2基因同时检出率为97.0%(32/33),sul1、sul2和sul3基因同时检出率为21.2%(7/33);所有耐药菌株均属于ST129型。以上结果表明,鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物具有一定的耐药性,其中的耐药菌株都属于同一序列型ST129,均携带有sul1耐药基因,且绝大多数耐药菌株同时携带sul1与sul2两种耐药基因,提示在福建、广东和江西等地需慎用磺胺类药物来防治该细菌的感染。     

湖南省猬迭宫绦虫的线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位l基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列重构猬迭宫绦虫与其它绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pcox1和pnad1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示所获得各样品株的pcox1和pnad1序列长度一致,分别为396和566bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。由于猬迭宫绦虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为猬迭宫绦虫的种群体遗传学研究和其相关疾病的诊断奠定基础。     

西北部分地区猪蛔虫rDNAITS基因序列测定及遗传变异分析

为了摸清西北部分地区猪蛔虫内转录间隔区(ITS)的遗传变异特点,扩增了猪蛔虫ITS基因,进行测序,依据GenBank公布的ITS序列将测序结果截为ITS1、5.8S及ITS2三段,分析比对各段序列的差异性。结果显示,所有样品ITS序列长约1 000bp,其中ITS1、5.8S和ITS2的长度分别为450bp~453bp、159bp、272bp,种内差异分别为0~0.2%、0、0。基于ITS1的种系发育分析表明,23个猪蛔虫样品均位于同一分支,而与贝蛔属蛔虫分属两个不同分支。ITS1序列不能作为区分西北不同地区猪蛔虫的种内分子标记,但可以作为区分蛔属蛔虫与贝蛔属蛔虫的种间分子标记,研究结果为猪蛔虫的鉴定和分子流行病学调查提供了基础资料。     

牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gB、gC、gD基因的分子克隆与序列分析

对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)内蒙古分离株gB、gC、gD基因进行克隆和序列测定,结果表明IBRV内蒙古分离株gB、gC、gD基因序列分别为2 850、1 723、1 559bp,编码933、508、417个氨基酸组成的完整开放阅读框。序列比较和系统进化树分析结果显示:内蒙古分离株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的相似性为94.9%～99.9%,其推导的氨基酸相似性在90.3%～99.7%,不同IBRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。在系统进化树中内蒙古分离株与瑞典毒株亲缘关系较近,属于同一个分支。     

食品动物源沙门氏菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的检测与分析

为了解食品动物源沙门氏菌质粒介导喹诺酮类耐药性(Plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR),采用微量肉汤稀释法和PCR方法,检测了316株食品动物源沙门氏菌对20种抗菌药物的敏感性,以及菌株中PMQR基因的携带率.结果显示:316株沙门氏菌对20种抗菌药物呈不同程度的耐药性,95.57％菌株为多重耐药菌;316株菌中未检出qnrA、qnrC、qnrD、qnrS和qepA基因,7.91％菌株检出qnrB基因,15.19％菌株检出aac(6 ′ )-Ib-cr基因,7.91％菌株检出oqxA基因,8.86％菌株检出oqxB基因,这是首次在沙门氏菌中发现oqxAB基因;98.11％PMQR阳性菌同时携带2种及以上的耐药基因,呈8～17耐的多重耐药性,其中以qnrB和aac(6′)-Ibcr基因型为主;53株PMQR阳性菌分属于5种不同的基因型,耐药表型或耐药基因型不同的菌株却有相同的PFGE谱型.本次检测的316株食品动物源沙门氏菌耐药较为严重;菌株主要携带qnrB、aac(6 ′ )-Ib-cr及oqxAB基因;不同来源菌株存在同一耐药克隆株的流行.     

四川省松潘县牦牛体表蜱、高原鼠兔携带巴尔通体和无形体的PCR检测与进化分析

旨在了解四川省松潘县牦牛体表蜱、高原鼠兔巴尔通体和无形体感染情况。采集牦牛体表的蜱和捕获高原鼠兔，对蜱进行形态学初步鉴定后，提取蜱和高原鼠兔脾总DNA，PCR扩增蜱16S rRNA、巴尔通体rpoB和无形体16S rRNA基因，对PCR产物阳性产物测序、比对及构建系统进化树，从而确定蜱种类及蜱和高原鼠兔感染巴尔通体和无形体的种类及感染率。结果显示：在松潘县进安乡、山巴乡、下八寨乡各采集到蜱102、97和131只，共计330只，经鉴定均为青海血蜱。蜱巴尔通体仅检出1种巴尔通体，与B.melophagi亲缘关系最近，进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为16.7%、8.2%和18.3%，其中下八寨乡检出率显著高于进安乡（P<0.05）；蜱源无形体进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为9.8%、12.4%和26.7%，下八寨乡检出率显著高于进安乡（P<0.01），检出的无形体均为1种，与牛无形体（A.bovis）亲缘关系最近；下八寨乡检出的鼠兔源巴尔通体与B.queenslandens亲缘关系最近，感染率为6.7%；进安乡、山巴乡和下八寨乡检出的鼠兔源巴尔通体与B.grahamii亲缘关系最近，感染率分别为8.7%、17.9%和13.3%，3个点检出率无显著差异；未定种Bartonella sp.（MN296294）和Bartonella sp.（MN296293）仅分别在进安乡和下巴乡检出；与蜱均检出无形体不同，高原鼠兔均未检出无形体。此外，蜱和高原鼠兔均未发现2种及2种以上病原混合感染。松潘县青海血蜱携带巴尔通体和无形体，高原鼠兔感染巴尔通体，且首次在高原鼠兔体内检测到疑似B.queenslandens的病原体，提示当地居民有感染这两类病原风险。     

肉牛溶血性大肠埃希菌分离鉴定和毒力与耐药基因检测及药敏试验

为了解肉牛溶血性大肠埃希菌毒力基因和耐药基因分布情况及药物敏感性,从河北省围场县采集的健康肉牛鼻腔棉拭子中分离鉴定溶血性大肠埃希菌,采用PCR检测大肠埃希菌的4个毒力基因和12个耐药基因,并采用K-B法进行药敏试验。结果表明,从116份健康的肉牛鼻腔中分离鉴定出23株溶血性大肠埃希菌,分离率为19.8%;毒力基因检测结果显示,6株菌同时携带LEE(Ler、eaeA)毒力基因,携带率26.1%,18株同时携带高致病性毒力基因HPIirp2、fyuA,携带率78.3%,6株同时携带LEE和HPI毒力基因,携带率为26.1%;耐药基因检测结果显示,blaTEM、aadA1耐药基因的携带率最高,为100%;药敏试验结果显示,23株溶血性大肠埃希菌对头孢氨苄、复方新诺明、磺胺间甲氧嘧啶耐药。结果表明,溶血性大肠埃希菌普遍存在于健康肉牛鼻腔中,HPI毒力基因和β-内酰胺类和耐链霉素类耐药基因携带率高。对河北省围场县肉牛溶血性大肠埃希菌毒力基因和耐药基因进行了研究,并进行药物敏感性分析,结果提示溶血性大肠埃希菌对肉牛养殖存在潜在威胁。     

鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析

自规模化养鸭场患典型大肠杆菌败血症雏鸭分离的282株致病性大肠杆菌（E.coli）中鉴定出210株（包含37种血清型）,其中O93、O78、O92、O76占43.8%（92/210）为优势血清型,O46、O32＆O93混合型、O60＆O93混合型为首次从鸭群中分离到。应用PCR结合核酸序列测定对210株致病性E.coli（鸭大肠杆菌病分离株）和28株自健康雏鸭泄殖腔拭子分离的E.coli（临床健康鸭大肠杆菌分离株）进行包括强毒力岛（HPI）中的鼠疫菌素受体基因（fyuA）和铁调节蛋白基因（irp2）、Ⅰ型菌毛必需蛋白基因（fimC）、P型菌毛结构基因（papA）和血清耐受基因（iss）检测,结果表明：fyuAi、rp2、fimC、papA和iss基因在鸭大肠杆菌病分离株的携带率分别为41.0%、43.3%、92.9%、97.6%和96.7%,在临床健康鸭大肠杆菌分离株的携带率分别为21.4%、25.0%、92.9%、100%和92.9%,患病鸭和临床健康鸭大肠杆菌分离株iss、fimC和papA携带率差异不显著（P〉0.05）,但papA的携带率均显著高于其他宿主（鸡、猪和人）源E.coli;HPI毒力岛在鸭源E.coli中分布较广,其携带率表现为鸭大肠杆菌病分离株极显著高于临床健康鸭大肠杆菌分离株。HPI毒力岛的携带率与菌株的致病性呈明显的正相关,与O78等特定的血清型有一定的关系。鸭大肠杆菌病分离株有37.6%（79/210）同时携带fyuAi、rp2、fimCi、ss和papA基因,极显著高于健康鸭大肠杆菌分离株的14.3%（4/28）（P〈0.01）。     

牦牛源牛冠状病毒部分基因的扩增、序列分析及病毒分离鉴定

本试验的目的是对青藏高原地区牦牛进行牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的分子流行病学调查,并分离牦牛源BCoV。采用RT-PCR方法检测西藏、青海、四川、云南的犊牦牛腹泻粪便中BCoV,并扩增其S、HE及N基因片段;选取阳性样本进行BCoV分离。结果显示:从336份犊牦牛腹泻粪便中检出232份BCoV阳性,检出率为69.05%。序列分析和系统发育分析显示,本试验克隆的32个BCoV阳性样本中的S1亚基序列、HE基因片段和N基因片段均有独特的遗传进化趋势;首次成功分离到1株牦牛源BCoV,蚀斑纯化后病毒TCID50为10-7.17·0.1mL-1,鉴定结果显示该毒株S基因发生了重组事件。本试验结果表明青藏高原牦牛源BCoV感染率很高,且有独特的遗传进化趋势。     

奶牛乳房炎源大肠埃希氏菌的耐药性分析和毒力基因检测

为了解奶牛乳房炎大肠埃希氏菌耐药性、毒力基因携带及分布情况,从2019年9月至2020年6月在新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉地区的7个奶牛场共采集了142份乳房炎奶牛牛乳样本,采用麦康凯培养基和伊红美蓝培养基进行筛选,利用生化试验和16S rDNA PCR方法鉴定出大肠埃希氏菌,用K-B纸片扩散法对分离株进行耐药性检测,PC...     

羊朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从6只羊（3只藏绵羊和3只山羊）全血中提取基因组总DNA，用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因，并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明所克隆的羊PrP基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，为包含在单一外显子内的完整开放阅读框，其与国外报道的已知序列基本相同。所克隆的羊PrP基因含5个短而富含G-C的元件，可编码八肽Pro—His—Gly—Gly—Gly—Trp-Gly—Gln或九肽Pro—Gln／His—Gly—Gly—Gly-Gly—Trp—Gly—Gln。这些PrP基因序列相比较，其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别在99．0％～100．0％和98．1％～100．0％之间。共发现17个碱基替换，其中6个为同义码替换、11个为异义突变。异义突变中，除SY200301～SY200303的S240P和MY200301的M112T外，其余均位于PrP氨基酸125～228的C-端球形结构区，分别为MY200301的G129S突变、MY200302的T191R突变、MY200303的G127S突变及SY200302和SY200303的H143R和R211G。6个羊PrP基因均为密码子136、154和171的PrPARQ等位基因。     

家蚕防御素基因的序列特征与表达模式分析及原核表达试验

家蚕防御素(defensin)是家蚕抗菌肽家族的主要成员之一,为家蚕先天性免疫的重要效应因子。采用生物信息学方法分析家蚕防御素基因BmdefA、BmdefB的序列中各有2个外显子,2个基因分别定位于家蚕第4号和第13号染色体上;等电点预测BmdefA带有负电荷,属于罕见的阴离子型抗菌肽,而BmdefB带有正电荷,属于常见的阳离子型抗菌肽;预测2个基因编码的成熟肽分子质量均在4 kD左右。用RT-PCR方法检测BmdefA在家蚕整个发育过程中有表达,且在检测的幼虫和成虫各组织中均有表达;BmdefB从幼虫5龄第3天到成虫期表达,雄性表达量高于雌性,且在5龄第3天幼虫的生殖腺、脂肪体和血细胞中高水平表达。家蚕防御素BmdefA、BmdefB具有不同的分子特性和表达特征,暗示它们在家蚕先天免疫过程中可能行使不同的功能,甚至可能具有不同的抗菌机理。构建融合GST标签的家蚕防御素基因原核表达载体,通过在大肠杆菌细胞内诱导表达,获得可溶性的目的蛋白,使用GST亲和层析柱初步纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting鉴定,为进一步研究BmdefA、BmdefB的体外活性和抑菌机制奠定基础。     

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。     

七彩山鸡内源性禽白血病病毒的鉴定及其env基因序列分析

为了解七彩山鸡感染内源性禽白血病病毒(ALV)情况,从上海某七彩山鸡场采集200份血浆样品,经DF1细胞分离和ALV p27抗原ELISA方法检测出13份阳性样品.将含有阳性样品的第一代细胞裂解液及细胞上清液同时盲传接种至第2代细胞,培养9 d后,p27抗原均未被检测到.对ALV p27抗原阳性细胞培养物进行env基因...