云南草果SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选

草果为药食两用的草本植物,近年来在市场上供不应求,但关于草果居群的分子鉴定及种质资源的研究极为稀少。为使云南草果产业更加健康和可持续的发展,本实验对云南草果进行了SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选,为研究草果遗传多样性提供了依据。实验采用L16(43)正交试验设计,对PCR反应体系中的3个因素(2×Taq PCR Starmix,引物, DNA模板)进行优化,并利用单因素分析法,对PCR退火温度、PCR扩增产物点样量进行实验与分析。最终确定5个因素的最佳水平,即DNA模板(50 ng/μL) 2μL,2×Taq PCR StartMix 6μL,正反引物(10μmol/L)各1.5μL,dd H2O补足至20μL (即加入ddH2O 9μL),PCR产物点样量可以选择在1.5～2μL之间。从48对SSR引物中筛选出了7对扩增结果好的引物。7个SSR引物可用于草果资源的遗传多样性研究,为分子技术研究提供了科学依据。     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L16(45)正交试验设计.通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg2+、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20 μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs...     

正交设计优化大豆SSR-PCR反应体系及引物筛选

以大豆(Glycine max L.)为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对大豆SSR扩增结果的影响,并确定影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量.以CTAB法提取的大豆叶片DNA为模板,应用L16(44)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响.大豆SSR-PCR优化反应体系为:2.0 μL 10×PCR Buffer,30 ng模板DNA,150μmol/L dNTP,0.4 μmol/LSSR引物,1.5 U Taq DNA聚合酶,2.0 mmoL/L Mg2+,加ddH2O至终体积20.0μL.优化的PCR扩增程序为:94℃预变性5 min.94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸5 min,4℃保存.同时选用200对大豆引物对2份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物74对,用于大豆SSR标记的进一步研究.     

二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

药用菊花SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为进一步开发利用药用菊花种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用L25(56)正交设计对影响药用菊花SSR-PCR反应的模板DNA、Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物等5个因素进行优化,并对SSR引物进行筛选。结果建立了药用菊花SSR-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng,正、反向引物0.25μmol/L,d NTPs 0.3 mmol/L,Mg2+3.0 mmol/L,Taq酶1.5 U。运用优化后的反应体系,从136对引物中成功筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物57对,大多数条带大小集中在100~500 bp,不同引物扩增的条带数为5~15条。优化的SSR-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,获得了稳定性、重复性良好和多态性丰富的扩增图谱。该体系的建立可为今后利用SSR标记对药用菊花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。     

牡丹SCoT分子标记正交优化及引物筛选

以牡丹基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计对影响目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应( SCoT-PCR)的五因素(Taq酶用量、Mg2+浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物浓度)进行优化试验,建立了优化的牡丹SCoT-PCR反应体系:Mg2+ 2.50 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol...     

马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选

本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。     

独脚金AFLP反应体系的优化及引物筛选

为了构建一套适合中国独脚金种质资源的AFLP反应体系,本研究以独脚金幼嫩茎叶为材料,对影响AFLP反应体系的酶切连接反应、预扩增和选择性扩增过程中的一些关键因素进行优化,并利用优化的反应体系对AFLP引物进行筛选。结果表明,最佳的酶切反应体系为DNA模板200 ng,MseⅠ/EcoRⅠ用量3 U,总体积20μL,37℃酶切反应时间3 h,72℃灭活20 min;最佳连接反应体系为T4连接酶5 U,16℃连接过夜;最佳预扩增反应体系为dNTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度2 U,总体积25μL;选择性扩增的反应体系为d NTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度1 U,预扩增产物稀释5～10倍,总体积10μL。采用优化的AFLP反应体系,对来自3个不同来源地的独脚金样本进行选择性扩增,100对引物组合均能扩增出清晰、丰富的条带,且在参试样本中均能表现出一定的扩增多态性。本研究筛选出的引物组合可用于后续独脚金种质资源遗传多样性的研究,为独脚金遗传多样性研究、种质资源保存和鉴定提供一定的参考。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

沙棘SCoT-PCR反应体系的优化及引物筛选

为获得沙棘SCoT-PCR最佳反应体系并筛选出适用引物,本研究采用正交试验设计与单因素试验设计的方法对其反应体系进行优化,并在此基础上对设计的80条引物进行筛选.试验结果表明:沙棘SCoT-PCR最佳反应体系(20μL)为:2×Taq PCR预混试剂Ⅱ用量9.8μL,模板DNA用量25 ng,引物浓度0.9 μmol/...     

冬瓜SSR-PCR体系优化及引物筛选

本研究利用L16(54)正交试验设计研究了影响冬瓜SSR-PCR的五个因子(10×Buffer(含Mg2+),d NTP,DNA,引物,r Taq),研究结果表明Buffer(含Mg2+)和r Taq对PCR影响最明显,最终筛选出最佳反应体系:10×Buffer 2.0μL(1×Buffer),d NTP 2.0μL(200μmol/μL),DNA 0.6μL(6 ng/μL),引物0.4μL(0.2μmol/L)。体系体积为20μL,循环数为35。引物筛选程序为:94℃预变性3 min,94℃变性45 s,58℃~68℃复性30 s,5个循环,每个循环退火温度降2℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃~58℃复性1 min,8个循环,每个循环退火温度降低1℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃复性30 s,72℃延伸1 min,共30个循环,72℃延伸7 min。本研究建立了适合冬瓜的SSR反应体系和引物多态性筛选程序。     

构建黍稷分子遗传图谱SSR引物的筛选

采用SSR-PCR扩增技术,将实验室利用高通量测序与磁珠富集法结合开发得到的1 210对黍稷SSR引物进行筛选,筛选出在会宁大黄糜、陇糜8号、太原55号和会宁野糜子4个黍稷品种之间表现出条带清晰、多态性明显、重复性较好的引物;并通过提取DNA以及PCR过程中退火温度的简单优化来建立比较适宜的黍稷SSR分子标记反应体系。结果表明,在DNA提取过程中将ddH2O的量减少到100μL,增加65℃的水浴时间并增加4%β-巯基乙醇和DNA浓度等可以获得较高质量的DNA。利用优化好的反应体系从1 210对SSR引物中筛选出116对多态性较好的引物,占总数的9.59%,其中,群体一的2个亲本所特有的引物有36对,群体二的2个亲本中特有的引物有97对,2个群体共有的多态性引物有19对;对引物碱基结构分析发现,选用的1 210对引物中有1 173个双碱基重复SSR和36个三碱基重复SSR;筛选到的多态性引物中双碱基重复SSR有102个。三碱基重复SSR有14个。筛选出的多态性SSR标记能用于黍稷的遗传多样性和群体遗传结构研究。     

海南油茶SCoT反应体系建立与多态性引物筛选

SCoT-PCR是一种单引物扩增分子标记。为了将SCoT分子标记应用于海南油茶的分子鉴定和遗传多样性评价中,本研究采用单因素试验和正交试验结合方法,分析模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物4种因素对海南油茶SCoT-PCR扩增结果的影响,构建海南油茶SCoT-PCR体系,并筛选多态性引物。单因素试验结果表明：DNA浓度对海南油茶扩增效率影响不大,高浓度dNTPs利于扩增产物,而Taq酶和引物扩增高效率偏于中浓度。正交试验结果表明：各因素对海南油茶SCoT-PCR扩增影响大小依次为引物>Taq DNA聚合酶>dNTPs>模板DNA;总体系为20μL时,最佳反应体系中模板DNA用量为30 ng,dNTPs浓度为0.30 mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.00 U。利用构建的SCoT-pcr体系对80条SCoT单引物进行筛选,最终筛选出16条SCoT条带清晰的多态性引物,多态性比率平均值达到76.25%。本试验结果可为海南油茶的遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究提供参考数据。