4种核酸染料在实验教学中的应用研究

分别使用4种核酸染料对凝胶中质粒DNA进行染色,紫外凝胶成像仪下观察和记录结果,比较4种核酸染料对琼脂糖凝胶中DNA的染色效果,并对结果进行比较分析。结果表明,EB价格低廉,对含量为50ng以上的DNA着色效果最好,亮度较暗;而Gold view与EB相比染色效果无太大差别,但是亮度比EB稍亮;Sybrgreen在这4种核酸染料中亮度很明显,且对含量为10ng以上的DNA就有荧光呈现;Ultra power对含量为5ng以上的DNA染色效果明显,亮度最亮。由于EB有强致突变性,微毒,而后3种核酸染料基本无毒性,安全可靠,因此,本着经济、方便、可靠的原则,在实验室中用Gold view足以满足一般需要;经济允许且在做荧光定量PCR、即时PCR时,最好选用Sybr green。     

核酸染色剂对DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速度的影响

核酸染色应用在许多DNA检测相关的技术领域,然而染色剂结合DNA会造成电泳迟滞。为研究溴化乙锭(ethidium bromide,EB)和GelRed这2种核酸染色剂对DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速度的影响,分别用这2种染色剂采用前、后染色的方法对DNA进行染色,以琼脂糖凝胶电泳作为检测方法,凝胶成像系统拍照观察,用Reptation理论分析数据。研究结果表明EB和GelRed染色均使DNA迁移发生了滞后,但EB对于目的基因片段大小的判读未受电泳滞后的影响,而GelRed对目的基因判读略有影响。然而,与EB相比,GelRed具有荧光效果强、安全、环保等诸多优点。总之,需要精确鉴定目的基因片段大小可以选择后染色或EB前染色,对于鉴定目的基因片段大小要求不高且需要荧光效果好、环保的染色剂可以选择GelRed。     

川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)RAPD和AFLP标记的多态性聚类分析

[目的]用RAPD和AFLP技术对采自主产区不同地域的川牛膝Cyathula officinalis Kuan.、头花杯苋Cyathula capitata(Wall) Moq及它们的杂交品种杂交牛膝Hybrid accsssion进行多态性和聚类分析研究。[方法]用酚-氯仿法提取的基因组DNA,经RAPD及AFLP程序扩增后分别用琼脂糖凝胶和PAGE电泳检测,使用NTSYSpc-2.10s软件用UPGMA方法对检测结果进行聚类。[结果]RAPD和AFLP技术在分析遗传多样性和品种鉴定方面各有优缺点;采自同一地方的川牛膝具有最近的亲缘关系,头花杯苋、杂交牛膝与其他采自各地的川牛膝品种之间的遗传差异较大。[结论]在川牛膝中,DNA的差异与地域性有较大关系,说明药材确有地道性的特征,从而在DNA水平上证明了药用植物上的地道性观点。     

四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中的染色特性

为了建立比溴化乙锭（EB）更为安全有效的核酸染色方法。用后染方法对Gelview、SYBR Green I、U1trapower TM和EB这4种核酸染料在琼脂糖凝胶中的染色特性进行比较分析。结果表明，Gelview和髓的灵敏度很高，SYBR Green I次之，Ultrapower TM最低。综合考虑，Gelview是替代EB的最好新型核酸染料。     

西施舌鳃蛋白质组学研究

[目的]研究西施舌（Coelomactra antiquate）鳃蛋白质组学。[方法]以西施舌的鳃组织为研究对象,经破碎、裂解和离心等抽提方法提取鳃组织蛋白质样品,利用Bradford蛋白质定量试剂盒作蛋白定量后,进行一向等电聚焦电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染色,利用Image ScannerⅢ扫描仪扫描凝胶,获得凝胶图像。[结果]经研究首次得到西施舌鳃蛋白质双向电泳图谱,初步构建了西施舌鳃蛋白质组的双向电泳技术体系。在pH值为4~7的范围内分布着大部的蛋白质,且多为酸性蛋白。其中,在低pH值区蛋白质分布较多,甚至还出现了高丰度蛋白质,在同一水平线上的蛋白质为分子量相近的蛋白质。[结论]该研究可为进一步探索西施舌鳃组织的生理生化机制奠定基础。     

中华桫椤DNA提取及ISSR分析

[目的]研究中华桫椤总DNA的提取方法。[方法]采用SDS法和改良CTAB法提取中华桫椤总DNA,通过电泳检测方法进行比较。[结果]用改良CTAB法得到的DNA浓度和纯度都较高,基本上无蛋白质、多糖等杂质。用改良CTAB法得到的总DNA进行ISSR-PCR扩增,谱带清晰,获得较好的效果。[结论]为提取高质量的DNA样品奠定了基础,并为探讨中华桫椤自然居群的遗传多样性和种群遗传结构及进一步保护和利用中华桫椤提供了分子遗传学依据,     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化（英文）

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA。从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-trnH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析。电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%NaOH)变性15min,采用6%的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3~4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCRSSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

5种金边瑞香基因组DNA提取方法比较研究

[目的]研究不同提取方法对金边瑞香基因组DNA提取质量的影响,筛选最佳提取方法。[方法]以金边瑞香叶片为试材,以SDS法、改良CTAB法、SDS-CTAB法、高盐低pH法和尿素法5种方法提取基因组DNA,并从DNA纯度、浓度、酶切电泳结果和ISSR-PCR扩增产物电泳等方面进行比较分析。[结果]高盐低pH法和尿素法提取的金边瑞香基因组DNA富含蛋白质和多糖等杂质,DNA纯度低;SDS法提取的基因组DNA含有一些酚类物质和盐等杂质,DNA纯度较低;改良CTAB法提取的基因组DNA纯度较高,但浓度和产率低。SDS-CTAB法提取的基因组DNA纯度、浓度和产率最高,酶切和ISSR-PCR产物电泳检测效果最好。[结论]SDS-CTAB法提取的金边瑞香基因组DNA质量与产量最佳,可以满足后续分子生物学研究的需求。     

鹧鸪茶种质资源ISSR分子标记中的引物筛选（摘要）

[目的]为快速和准确地对鹧鸪茶种质材料进行ISSR分析提供有效引物。[方法]基因组DNA的提取采用改良的CTAB法：先用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,EB染色,以Lambda DNA/HindⅢ＋Eco RIMarkers为参照,电泳结果用Gel Doc XR型凝胶成像分析系统下照相并记录。再用Biophotometer紫外分光光度计分别测定OD_（260）和OD_（280）,并计算出OD_（260）/OD_（280）值,每份样品的OD_（260）/OD_（280）比值均要求在1.8～2.0范围内。测定每份样品DNA浓度（ng/μl）,并将其稀释至20 ng/μl,分装后置-20℃保存。利用99个ISSR引物,对来自海南岛境内的10个居群中共20份鹧鸪茶种质材料进行PCR扩增,以筛选出适合于所有鹧鸪茶种质材料ISSR分析的有效引物。[结果]从99个供试引物中共筛选出15个多态性丰富、条带清晰且可重复性良好的有效引物。用筛选出的15个引物对66份鹧鸪茶种质材料进行ISSR-PCR扩增,均可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱;15个引物共扩增出286条DNA谱带,其中231条为多态性带,占总扩增带数的80.77%,平均每个引物扩增出19.1条谱带。[结论]所筛选的15条引物可以有效地应用于鹧鸪茶种质资源材料的ISSR分析。     

山楂PCR－SSCP反应体系与反应条件的优化

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA,对PCR-SSCP引物进行筛选,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]rop B、rop L、rpo C1、ITS2、psb A-trn H 5对引物适用于山楂PCR-SSCP分析。电泳时,采用6%聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),4℃恒温,200 V恒压,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%Na OH)变性15 min,电泳缓冲液为0.5×TBE,电泳3~4 h可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCR-SSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

铬胁迫对小麦幼苗叶片DNA含量的影响

[目的]研究Cr6＋对小麦幼苗叶片DNA含量的影响。[方法]用5~100 mg/LCr6＋分别处理3和10 d龄小麦幼苗,紫外分光光度法和电泳法测定DNA含量变化。[结果]Cr6＋处理的小麦幼苗叶片DNA含量显著降低,3 d龄幼苗叶片DNA含量的下降幅度大于10 d龄幼苗。电泳图谱表明,对照叶片DNA带基本完整,而Cr6＋处理的DNA则发生了降解,出现拖尾现象。[结论]Cr6＋处理减少了小麦幼苗叶片DNA含量,进而影响其正常生长。6＋     

仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术的优势（摘要）

[目的]研究仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术,为单细胞凝胶电泳技术寻求另一种可行的电泳方法提供参考。[方法]将仿火箭电泳方法应用于单细胞凝胶电泳技术,检验单细胞水平上的DNA损伤,并与传统的电泳方法比较,分析其优劣势。[结果]在细胞DNA未受损状态下,2种电泳方法所得的结果一致;而在细胞DNA受到损伤时,传统的电泳方法下一些细胞的慧尾发散出现漂移,仿火箭电泳方法得到的慧尾图像集中且未发生偏移。[结论]仿火箭电泳方法较传统的电泳方法存在一定优势。     

快速提取玉米DNA方法的研究

[目的]为了探索一种快速、简便,能够用于SSR分析的玉米DNA提取法。[方法]采用改进的常规DNA提取法和DNA快速提取法提取玉米种子胚和黄化苗叶片中的DNA,进行SSR分析,通过琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对SSR产物进行检测。[结果]用常规法提取时,用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次就可获得质量好和浓度高的DNA;无须抽提,直接吸取上清液,可得到高浓度的DNA,也能满足SSR分析的需要;同样的提取法,SDS的提取效果比CTAB好。对快速提取法进行分析表明,相同的提取液和提取方法,采用种子胚提取的DNA浓度和质量明显高于叶片DNA。[结论]该研究为SSR在玉米种质及纯度鉴定上的应用提供了技术上的保证,有利于该项技术的普及和推广。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测致病疫霉菌SSR标记方法改良

[目的]改进聚丙烯酰胺凝胶电泳检测致病疫霉菌SSR标记方法。[方法]以2009年在宁夏固原地区采集的马铃薯晚疫病样为试验材料,提取其DNA,PCR扩增,并将其产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。[结果]采用12%聚丙烯凝胶电泳检测引物D13、G11,8%聚丙烯凝胶电泳检测引物PI4B、PI63、SSR4,最后采用0.1%硝酸银染色,取得了比较理想的电泳及染色效果。[结论]该研究建立的适用于致病疫霉菌SSR标记的电泳和染色技术方法具有检测灵敏度高、操作简单、获得的条带清晰等特点,是一种行之有效、简便快捷的检测方法。     

UV-C辐射对拟南芥基因组完整性及蛋白表达的影响

[目的]探究UV-C辐射对基因组完整性及蛋白表达的影响。[方法]CTAB法提取拟南芥基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。用TCA/丙酮法提取叶片总蛋白,通过SDS-PAGE凝胶检测蛋白表达变化。[结果]拟南芥基因组DNA随UV-C辐射时间的延长断裂明显增强、并诱导产生1条分子量约为66 kDa的蛋白条带。[结论]UV-C辐射可以引起拟南芥基因组DNA的断裂,对蛋白也有一定程度的影响。     

仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术的优势(摘要)(英文)

[目的]研究仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术,为单细胞凝胶电泳技术寻求另一种可行的电泳方法提供参考。[方法]将仿火箭电泳方法应用于单细胞凝胶电泳技术,检验单细胞水平上的DNA损伤,并与传统的电泳方法比较,分析其优劣势。[结果]在细胞DNA未受损状态下,2种电泳方法所得的结果一致;而在细胞DNA受到损伤时,传统的电泳方法下一些细胞的慧尾发散出现漂移,仿火箭电泳方法得到的慧尾图像集中且未发生偏移。[结论]仿火箭电泳方法较传统的电泳方法存在一定优势。     

仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术的优势

[目的]研究仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术,为单细胞凝胶电泳技术寻求另一种可行的电泳方法提供参考。[方法]将仿火箭电泳方法应用于单细胞凝胶电泳技术,检验单细胞水平上的DNA损伤,并与传统的电泳方法比较,分析其优劣势。[结果]在细胞DNA未受损状态下,2种电泳方法所得的结果一致;而在细胞DNA受到损伤时,传统的电泳方法下一些细胞的慧尾发散出现漂移,仿火箭电泳方法得到的慧尾图像集中且未发生偏移。[结论]仿火箭电泳方法较传统的电泳方法存在一定优势。     

海水养殖凡纳滨对虾肌肉组织蛋白质组学研究

[目的]建立分析海水养殖凡纳滨对虾肌肉组织蛋白的双向电泳图谱及技术体系。[方法]采用裂解、离心等抽提方法提取凡纳滨对虾肌肉蛋白样品,利用bradford蛋白定量试剂盒作蛋白定量后,进行一向等电聚焦电泳和二向聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后的凝胶采用考马斯亮蓝染色,利用ImageScannerⅢ扫描仪扫描凝胶,获得凝胶图像。[结果]经双向电泳图谱分析显示,所获得的凡纳滨对虾肌肉蛋白点分布于pH值4．0—7．0之间,大部分蛋白为酸性蛋白,其中有部分蛋白可能存在同分异构体,高pH值区蛋白分布相对较少。[结论]首次获得海水养殖凡纳滨对虾肌肉蛋白质的双向电泳图谱,初步建立了海水养殖凡纳滨对虾肌肉组织双向电泳技术体系．可为进一步探索海水养殖凡纳滨对虾的生理生化机制及比较蛋白质组学研究提供理论依据和技术保障。     

兴安落叶松DNA提取-试剂盒改良法

[目的]寻找一种快速简便的兴安落叶松基因组DNA的提取方法。[方法]对DNA提取试剂盒进行改良,与原试剂盒法(离心柱)进行比较,并用琼脂糖凝胶电泳、蛋白核酸测定和ISSR-PCR对所提取的总DNA进行检测。[结果]试剂盒改良法提取的总DNA纯度和浓度较高,电泳显示其主条带较清晰,无降解现象,A260/A280值为1.75～1.84。[结论]改良后的DNA提取方法更适合兴安落叶松基因组DNA的提取。     

快速小量提取小麦叶片DNA的一种简易方法

[目的]寻求少量、快速提取小麦幼叶DNA的方法。[方法]以小麦幼叶为试验材料,用改良的CTAB法小量快速提取转基因小麦总DNA。所提取的DNA以0．8％琼脂糖凝胶电泳检测。[结果]改良的CTAB法提取小麦基因组DNA所提取的DNA纯度高、无降解现象,适用于进行常规PCR扩增。[结论]该研究为小麦DNA的提取提供了一种所需材料量少、简便、快速的方法。