连翘酯苷对小鼠的急性毒性及体内诱生IFN-α的研究

测定连翘酯苷对小鼠腹腔注射急性毒性试验的半数致死量(LD50),检测连翘酯苷体内诱生干扰素的效果.腹腔注射连翘酯苷,用改良寇氏法计算半数致死量.眼部采血,ELISA方法测定血清中IFN-α.测得连翘酯苷对小鼠腹腔注射急性毒性的LD50为1 976.5 mg/kg,LD50的95%可信限为1 863.7 mg/kg～2 096.1 mg/kg.连翘酯苷诱生干扰素在48 h达到最高峰845.8 pg/mL±150.92 pg/mL(P＜0.01).表明连翘酯苷为低毒化合物,体内能够诱生IFN-α.     

黄芩苷对小鼠的保胎作用及其对细胞因子的影响

本试验旨在研究黄芩苷的促孕保胎作用及其对母胎界面细胞因子的影响。取怀孕小鼠分成5组,除对照组外,其它4组于孕5-7天皮下注射溴隐亭建立流产模型,孕1-7天分别灌服蒸馏水、0.1、0.51、mg黄芩苷。孕3、5、7、10、12天采样,计算流产率,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及子宫匀浆中干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)、孕酮的含量。结果孕12天时1 mg黄芩苷组流产率降低,接近对照组,与模型组均有显著差异。孕5天各组血清和子宫匀浆中IFN-γ含量显著上升,其中1 mg黄芩苷组最高。孕酮含量随孕期延长而提高,以0.5和1 mg黄芩苷组最高。表明黄芩苷可剂量依赖性上调孕酮的含量,促进着床期IFN-γ分泌,胚泡附植后又降低IFN-γ的含量,调节着床和妊娠期Th1/Th2细胞因子平衡,影响内分泌-免疫网络,有利于胚胎着床和妊娠维持。     

硫酸软骨素对大鼠心肌膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ的影响

研究硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)对微血管内皮细胞(MVECs)分泌IFN-γ的影响,为进一步研究CS的免疫增强机制提供资料。体外培养大鼠心肌膜微血管内皮细胞(RMMVECs),CS分为10、50、500 μg/mL 3个浓度组刺激RMMVECs,ELISA法检测药物处理后细胞上清液中IFN-γ的含量。结果显示,RMMVECs正常情况下能够分泌一定量的IFN-γ,经CS处理后IFN-γ的分泌量显著升高,且3个剂量组在刺激后24 h分泌量均达到峰值。结果表明,CS诱导大鼠心肌膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ可能是其免疫增强作用机制之一。     

HPLC法同时测定连花柴芩可溶性粉中4种有效成分含量

建立HPLC法同时测定连花柴芩可溶性粉中绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷的含量。采用Venusil XBP C18分析柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.1%磷酸水为流动相,1.0 mL/min的流速下进行梯度洗脱,320 nm波长处对4种成分进行含量测定。结果表明,在此色谱条件下,4种组分分离度良好,分别在3.28~26.24 μg/mL、3.17~25.36 μg/mL、6.08~48.64 μg/mL及8.81~70.48 μg/mL范围内线性关系良好,加样回收率均大于96.61 %,RSD均小于1.75 %。该方法简便、快速、准确,重复性良好,可用于连花柴芩可溶性粉中绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷的同时测定。     

血浆中连翘酯苷高效液相色谱检测方法的建立

为建立测定血浆中连翘酯苷含量的高效液相色谱方法,将血浆样品经去蛋白处理,以乙腈-水-醋酸(18∶82∶0.41)为流动相,流速为1 mL/min,检测波长为332 nm,柱温为25 ℃,进样量为10 μL,经Angilent ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6 mm×250 mm)色谱柱分离,进行色谱分析。结果表明,本方法连翘酯苷的血浆浓度在0.05~200 μg/mL内线性关系良好,精密度和重复性试验RSD均小于5%。本方法简便、灵敏、重现性高,可用于连翘酯苷的药动学和相对生物利用度的研究。     

PRRSV体外感染PAMs对IFN-γ mRNA转录水平的影响

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)对IFN-γmRNA转录水平的影响,选用PRRSV血清抗体和抗原均为阴性的4周龄健康仔猪3头,无菌分离PAMs,随机将其分为对照组、PRRSV感染组(PRRSV组)、PRRSV+PHA组和RRRSV+Dex组,分别在培养6、12、24、48和60 h收集PAMs。运用荧光定量PCR检测IFN-γ和PRRSV mRNA转录情况。结果显示,PRRSV mRNA转录量在感染PAMs后6~24 h逐渐升高,在48 h有所下调,在60 h再次升高,IFN-γmRNA转录量在6~48 h逐渐升高,24、48 h显著高于对照组,而到60 h又恢复到对照组水平;与同时间点的PRRSV组相比,PRRSV+PHA组中PRRSV mRNA转录量有所下调,IFN-γmRNA转录量有所上调;而RRRSV+Dex组PRRSV mRNA转录量有所上调,IFN-γmRNA转录量所下调。结果表明,IFN-γ在一定程度上可以抑制PRRSV在PAMs中的增殖,IFN-γ的抑制可能是PRRSV导致细胞损伤的机制之一。     

葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对肠毒素大肠杆菌(ETEC)生长及毒力相关基因mRNA表达的影响

为了研究葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对肠毒素大肠杆菌(ETEC)生长及分泌毒素的影响,在ETEC菌液中加入终浓度为200μg/mL的葛根素,终浓度为1μg/mL的黄芩苷,以及终浓度为100μg/mL的盐酸小檗碱,检测葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对ETEC生长情况、菌毛亚基蛋白FaeG以及毒力因子(STa、STb和LT) mRNA表达的影响,结果发现,葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对ETEC的生长有一定的抑制作用,其中黄芩苷可显著抑制ETEC分泌外毒素。     

甘草酸苷对体外小鼠单核巨噬细胞细胞因子分泌的影响

为研究甘草酸苷(GL)对小鼠单核巨噬细胞细胞因子分泌的影响,本实验以100μg/mL的GL溶液处理小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),培养后收集培养上清,采用ELISA法测定其水平。结果显示,GL能够显著提高培养上清中IFN-α(p<0.01)、IFN-β(p<0.05)和IFN-γ(p<0.01)水平,降低促炎因子IL-1β(p>0.05)、IL-6(p<0.05)、IL-12(p>0.05)和CXCL10(p<0.05)含量,并增加TGF-β的分泌(p>0.05)。这表明,GL可以通过诱导小鼠单核巨噬细胞产生IFN-α、IFN-β和IFN-γ而发挥抗病毒作用,同时能够抑制促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12和CXCL10的产生,并促进抑炎因子TGF-β的分泌,从而增强细胞的抗炎能力。本研究为进一步明确GL免疫调控作用机制提供了实验依据。     

连翘酯苷对体外培养细胞的毒性研究

探讨了连翘酯苷对体外培养细胞的毒性,以期为人们更好地研究利用连翘酯苷提供实验依据。实验采用细胞病变法观察连翘酯苷对猪肾细胞（PK-15）、猴肾细胞（Mare-145）、鸡胚肾细胞（CEK）、鸡外周血淋巴细胞（PBL）等4种细胞的形态损伤;用MTT法检测连翘酯苷作用这4种细胞后的细胞活性和细胞数量的变化。根据这两种方法的结果计算出连翘酯苷对这4种细胞的半数致死量。实验结果显示高剂量的连翘酯苷可致细胞发生病变,而低剂量组的细胞形态优于对照组。经SPSS16．0统计,连翘酯苷对PK-15、Mare-145、CEK3种细胞的半数致死量分别为137．8、87．1、384．4μg／mL,对PBL应用到中华人民共和国兽药典（2000年版）规定药量的10倍剂量,结果未发现致死性。因此,适当合理的连翘酯苷用量对体外培养的细胞没有毒性,反而有一定的维持细胞形态的营养作用和刺激细胞增殖的作用。     

刺五加多糖对鸡淋巴细胞体外增殖及细胞因子mRNA表达水平的影响

研究刺五加多糖(ASPS)对鸡淋巴细胞体外增殖及细胞因子mRNA表达水平的影响。将不同浓度的ASPS添加到体外分离培养的血液淋巴细胞中，采用噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞增殖变化，以实时荧光定量PCR方法检测淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA表达水平。结果显示，ASPS可以单独或协同植物血凝素(PHA)或脂多糖(LPS)促进淋巴细胞体外增殖，并且ASPS在质量浓度为200μg/mL时效果最佳。另外，ASPS能够促进淋巴细胞细胞因子mRNA的表达，当200μg/mL的ASPS与淋巴细胞体外共培养至24 h时，IFN-γ、IL-2、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的mRNA表达量均最高，而IL-4和IL-10 mRNA的相对表达量则以ASPS质量浓度为400μg/mL和培养时间48 h条件下最高，说明IL-4和IL-10 mRNA的表达滞后，而且呈剂量依赖性。结果表明，ASPS能够提高鸡淋巴细胞的体外增殖功能，促进Th1和Th2细胞因子分泌，这为进一步揭示刺五加多糖的免疫调节机制奠定了基础。     

连翘酯苷A对内毒素致鸡脾淋巴细胞白介素-1β的影响

试验旨在研究内毒素和连翘酯苷A对鸡脾淋巴细胞中白介素-1β(IL-1β)水平的影响,将1日龄雏鸡常规饲养至50日龄时,心脏采血处死后,无菌剖检取脾,并用鸡脾淋巴细胞分离液将鸡脾淋巴细胞分为20个组,具体为5个时间点×4个剂量组=20个组。作用时间分别为0、6、12、24和48 h,作用剂量组分别为对照组、内毒素(LPS)组(5μg/m L)、连翘酯苷A预防低剂量组(5μg/m L LPS+200μg/m L连翘酯苷A)和连翘酯苷A预防高剂量组(5μg/m L LPS+400μg/m L连翘酯苷A)。按上述方法培养后,收集鸡脾淋巴细胞,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测鸡脾淋巴细胞中IL-1β水平。ELISA结果显示:与对照组相比,LPS组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量下降,并与连翘酯苷A添加剂量呈正相关。qRT-PCR结果显示:与对照组相比,LPS组鸡脾淋巴细胞中IL-1βmRNA表达量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1βmRNA表达量下降,并呈剂量时间效应。试验表明LPS可以诱导鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量升高,而连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量下降,表明连翘酯苷A可以通过转录和翻译途径抑制LPS诱导的鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量的升高,减轻炎症反应,发挥抗炎功能。     

牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定

为高效分泌表达牛α干扰素(boIFN-α),本研究通过人工合成boIFN-α基因,将目的基因克隆至表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-boIFN-α,将其电转化于毕赤酵母菌株GS115,利用抗药选择压力G418筛选重组菌,对重组菌诱导表达,取上清进行SDS-PAGE和western blot检测,并优化重组菌的诱导表达条件.结果显示:筛选获得高效分泌表达boIFN-α的重组菌,其最佳诱导条件为:250 r/min,26℃培养,1％甲醇浓度诱导,诱导72 h.上清中目的蛋白表达量最高可达200 μg/mL,本研究为boIFN-α在生产中的应用奠定了基础.     

IFN-γ诱导感染牛分枝杆菌的THP-1细胞凋亡及AIF信号通路

将质量浓度为15 μg/L的IFN-γ作用于不同荆量M.bovis(MOI 10:1,20:1)北京株感染的THP-1细胞,在感染后12,24,36,48、72 h,使用流式细胞仪测定其细胞凋亡百分比.结果表明:IFN-γ诱导了牛分枝杆菌北京株感染的细胞凋亡,并且凋亡呈时间相关性.在相同时间,感染剂量为MOI 10:1和MOI 20:1的THP-1细胞经IFN-γ诱导后,细胞凋亡数无显著差异(P>0.05).将IFN-γ(15 μg/L)和牛分枝杆菌北京株(MOI 10:1)处理的THP-1细胞孵育36 h后,使用免疫细胞化学的方法检测细胞核内凋亡诱导相关因子(AIF)的变化,结果发现,细胞核内牛分枝杆菌单独感染和IFN-γ刺激的牛分枝杆菌感染的巨噬细胞的AIF的百分比分别为(11.38±1.00)%和(23.26±1.85)%,两者相比差异显著(P<0.05).表明在IFN-γ诱导的牛分枝杆菌感染的THP-1细胞凋亡过程中,AIF介导的凋亡信号通路被激活.本研究首次报道了在IFN-γ诱导的牛分枝杆菌北京株感染的THP-1细胞凋亡过程中AIF相关信号通路,对阐明IFN-γ在牛分枝杆菌感染中的作用机制具有重要意义.     

连翘酯苷A对内毒素致鸡脾淋巴细胞白介素-6的影响

试验旨在研究内毒素和连翘酯苷A对鸡脾淋巴细胞中炎症因子白介素-6(IL-6)水平的影响,将1日龄雏鸡正常饲养至50日龄时,心脏采血处死,表面消毒后,剖检分离鸡脾脏,用脾淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞,将脾淋巴细胞共分为20个组,具体为4个剂量组×5个时间点=20个组。4个剂量组分别为:对照组、LPS组(5μg/m L)、连翘酯苷A低剂量预防组(5μg/m L LPS+200μg/m L连翘酯苷A)、连翘酯苷A高剂量预防组(5μg/m L LPS+400μg/m L连翘酯苷A)。5个时间点分别为:0、6、12、24、48 h,经内毒素和连翘酯苷A处理不同剂量和不同时间后,收集脾淋巴细胞,通过采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法检测脾淋巴细胞中IL-6水平。ELISA结果显示:与对照组相比,LPS组脾淋巴细胞中炎症因子IL-6蛋白含量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A不同剂量预防组脾淋巴细胞中IL-6蛋白含量均下降,表明脾脏中IL-6蛋白含量的变化与连翘酯苷A的剂量呈正相关性,通过抑制LPS诱导的鸡脾脏中IL-6蛋白含量的升高,可减轻炎症反应。q RT-PCR结果显示:与对照组相比,LPS组脾淋巴细胞中IL-6 mRNA表达量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A不同剂量预防组脾淋巴细胞中IL-6 mRNA表达量均下降,IL-6 mRNA表达量与连翘酯苷A的剂量呈负相关性,试验表明连翘酯苷A可以通过转录水平抑制LPS诱导的鸡脾淋巴细胞中IL-6 mRNA表达量的升高,减轻炎症反应。结果表明,连翘酯苷A抑制鸡脾淋巴细胞中IL-6水平,对免疫功能有一定免疫影响,具有抗炎功能。     

连翘酯苷诱生干扰素-γ对AAⅠ诱导的RTECs转分化的影响

体外培养小鼠RTECs,将其随机分为6组,CCK-8法测连翘脂苷对RTECs的增殖率及存活率的影响,ELISA检测转化生长因子β1（TGF-β1）和干扰素-γ的含量,RT-PCR和Western blot检测CK18和Smad7等相关因子的表达变化。结果显示连翘酯苷质量浓度为160mg/L以下对RTECs无毒性,且诱生干扰素2.392μg/L;用药E组与模型B组比较TGF-β1表达显著下降（P〈0.01）;用药组与模型组相比Smad7mRNA极显著高表达（P〈0.01）、CK18mRNA显著高表达（P〈0.05）,而vimentin、α-SMA mRNA抑制表达（P〈0.01）;Western blot结果表明上调了Smad7的表达量。试验表明连翘脂苷可以提高Smad7的表达量,阻止Smad2/Smad3磷酸化,抑制TGF-β1/Smads信号通路,有效改善AAI诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

连翘酯苷A抗大鼠类风湿性关节炎机制研究

[目的]探讨连翘酯苷A对类风湿性关节炎大鼠的抗炎作用及作用原理。[方法]将30只SD大鼠[体重(120±2)g],随机分成3组,每组10只,分别为对照组(A组)、类风湿性关节炎组(B组)和连翘酯苷A治疗组(C组)。首先构建大鼠类风湿性关节炎模型,再观察各组大鼠临床症状、血清中TNF-α蛋白表达量、抗氧化酶和自由基含量。[结果]类风湿性关节炎模型组大鼠血清中TNF-α蛋白表达量增加,SOD含量下降,NO含量上升;而连翘酯苷A治疗组上述指标的趋势正好与之相反。[结论]连翘酯苷A可通过抑制炎症因子TNF-α的含量,并干扰TNF-α蛋白的翻译,影响抗氧化酶及自由基含量,最终发挥抗炎功效。     

黄芩苷对H6N6禽流感感染小鼠肺损伤的影响

为探究黄芩苷对H6N6禽流感病毒感染小鼠肺损伤的影响，选取108只昆明小鼠，随机平均分为6组(对照组、阳性组、西药组和低、中、高剂量黄芩苷组)。攻毒3 d后用不同剂量黄芩苷连续治疗9 d,各组在第3,6,9天时随机选6只小鼠，取其肺脏进行病理观察及HE染色制作切片，检测肺组织病毒含量及小鼠血清中IL-1、TNF-α、IFN-γ和5-HT含量。结果表明：攻毒3 d后，相比对照组，其余各组小鼠肺脏出现病理损伤；治疗3 d时，相比阳性组，高剂量黄芩苷组小鼠肺脏指数、病理评分和病毒含量均显著降低(P<0.05),治疗6 d时，相比阳性组，低、中、高剂量黄芩苷组小鼠血清中IL-1、TNF-α、5-HT含量均极显著降低(P<0.01),中、高剂量黄芩苷组IFN-γ均极显著升高(P<0.01);相比西药组，高剂量黄芩苷组小鼠肺脏指数、病理评分、病毒含量及血清中IL-2含量均无显著差异(P>0.05)。说明黄芩苷通过降低病毒在肺脏中的复制，调节血清中炎性因子(IL-1、TNF-α、IFN-γ和5-HT)含量，减轻H6N6禽流感患鼠肺的损伤。     

黄连解毒散超微细粉中黄芩苷在家兔体内的药代动力学研究

采用高效液相色谱法测定灌胃给予黄连解毒散超微细粉和细粉的家兔血浆中黄芩苷的浓度,血药浓度-时间数据经药代动力学分析软件(Pharmaceutical Kinetics Software,PKS)处理,比较黄连解毒散超微细粉和普通细粉中黄芩苷在家兔体内的药代动力学参数。结果如下:黄连解毒散超微细粉组、普通细粉组黄芩苷的药代动力学最佳模型均为二室开放模型。黄连解毒散超微细粉主要药动学参数:Ka=0.497 h-1,t1/2α=2.556 h,t1/2β=8.46 h,AUC0→∞=3.401μg.h/mL,Vd=6.752 L/kg,Tpeak=3.005 h,Cmax=0.311μg/mL;黄连解毒散普通细粉主要药动学参数:Ka=0.419 h-1,t1/2α=2.74 h,t1/2β=5.83 h,AUC0→∞=2.611μg.h/mL,Vd=12.890 L/kg,Tpeak=3.645 h,Cmax=0.215μg/mL。与细粉比较,黄连解毒散超微细粉中黄芩苷的相对生物利用度提高了30.26%。上述结果表明,黄连解毒散经超微粉碎后吸收相增大,可显著提高其有效成分黄芩苷的生物利用度。     

连翘酯苷的研究进展

连翘酯苷作为连翘属植物中的主要有效成分之一,目前被广泛研究.连翘酯苷是一种还原剂,具有多种药理作用,包括有很强的抗菌活性,其抗菌谱广,并有较强的抗病毒和抗氧化活性,还有解热镇痛和免疫调节作用,为此,是一种多功效的中药活性成分,具有较大的研究价值.     

黄芪水煎液诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞增殖以及分泌IFN-γ的研究

为了探讨黄芪水煎液能否诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)表达IFN-γ,采用MTT和双夹心ELISA分别检测了黄芪水煎液对体外培养的RIMMVECs增殖以及表达IFN-γ的影响。结果显示,黄芪水煎液在25mg/L~3 200mg/L时促进RIMVECs增殖。为更好的研究黄芪水煎液诱导效果,将不同浓度的黄芪水煎液(0.1、1、6、30mg/mL)诱导RIMVECs 6、12、24h检测IFN-γ含量,结果显示,在各检测时间点0.1、1mg/mL组和空白组差异显著(P0.05),6mg/mL组差异极显著(P0.01),30mg/mL组差异不显著(P0.05)。说明黄芪水煎液的抗病毒作用可能与诱导微血管内皮细胞表达IFN-γ有直接的关系,为黄芪"益气解毒"功效的现代阐释提供了试验依据。