转Bt基因抗虫棉抗虫性遗传研究

以转 Bt基因抗虫棉 R55为材料 ,利用ELISA( Enzyme-linked Immunosorbent Assay)检测方法 ,通过对不同亲本与抗虫亲本 R55杂交F1～ F5、BC1、BC2 世代材料 Bt晶体杀虫蛋白的定性、定量测定 ,结合大田自然感虫条件下的抗棉铃虫鉴定 ,研究了转 Bt基因抗虫棉 Bt基因的遗传规律。结果表明 :F1均表现阳性 ,F2 阳、阴性株符合 3∶ 1的分离比例 ,回交 BC1阳、阴性株呈现 1∶ 1的分离比例 ,说明 Bt基因的遗传基本符合显性主基因遗传规律。但 Bt基因的遗传又有其特殊性 ,表现在亲本的遗传背景对 Bt基因的表达有着较大影响 ,不同亲本与抗虫亲本杂交 F1代 Bt晶体蛋白的表达量存在较大差异 ;杂交方式对 Bt基因的表达亦有一定影响 ;不加选择的连续回交 ,有可能使 Bt基因“丢失”。未发现 Bt基因的表达随世代的递增、农艺和经济性状的改进而降低的趋势 ,Bt基因可以稳定遗传     

转Bt+GNA双价基因抗虫棉花中抗虫基因及其抗虫性的遗传稳定性

采用PCR和PCR-Southern跟踪检测,Bt和GNA两个抗虫基因在转Bt+GNA双价基因抗虫棉花TL1的3个连续世代均稳定存在,完全连锁遗传;室内棉铃虫生物测定表明,该转基因植株的3个世代都高抗棉铃虫,各世代之间抗性水平一致,没有显著性差异;温室蚜虫抗性试验显示3个世代均对蚜虫具有较好的抑制作用,且抑制效果相当。因而,两个抗     

不同转基因棉的抗虫性与Bt毒蛋白含量关系研究

转单价 Bt基因棉和转双价 ( Bt+ Cp TI)基因棉对棉铃虫抗性的时空动态及其 Bt毒蛋白含量变化表明 ,无论是单价 Bt基因还是双价 ( Bt+Cp TI)基因 ,对棉铃虫均有明显的抗性 ,呈现明显的时空动态变化。单价 Bt基因在花铃期以前抗性不如双价 ( Bt+ Cp TI)基因 ,在花铃期单价 Bt基因棉花营养器官的抗性稍好于双价 ( Bt+ Cp TI)基因 ,但生殖器官的抗性不如双价 ( Bt+ Cp TI)基因。转单价 Bt基因棉和转双价 ( Bt+ Cp TI)基因棉的 Bt毒蛋白含量时空动态变化趋势与各自的抗虫性相一致。但转双价 ( Bt+ Cp TI)基因棉的Bt毒蛋白表达量在棉株各生育期同一器官及同一生育期不同器官均比转单价 Bt基因棉略低 ,说明 Cp TI基因对棉铃虫也有一定的抗性     

回交二代玉米转Bt基因材料抗虫性鉴定研究

采用室内喂虫和田间接卵两种方法对４个玉米回交二代转基因材料进行了抗虫性鉴定。结果表明,不同转基因材料的抗虫性不同;同一材料的不同单株间的抗虫性各异,有的表现高抗性,有的几乎没有抗性,正反双向回交的结果,其抗虫性存在显著差异,外源Ｂｔ基因通过雌配子的传递率显著高于通过雄配子的传递率。因此,以抗虫株作母本进行正向回交是较为有效的回交方法。     

抗虫杂交棉F1代与亲本Bt蛋白表达量及抗虫差异性研究

对转 Bt基因抗虫杂交棉正、反交 F1代与抗虫亲本的 Bt蛋白表达量及抗棉铃虫差异性研究表明 :抗虫亲本与其杂种 F1代均高抗棉铃虫 ,但抗虫亲本的抗虫性略好于其杂种 F1代 ,并且明显地高于非抗虫亲本 ;正、反交杂种 F1代间的抗虫性几乎没有差异。生长前期的抗虫性好于后期 ,同一时期嫩叶或侧枝生长点的抗虫性好于幼蕾。抗虫亲本叶片和花瓣的 Bt蛋白含量明显地高于其杂种 F1代 ,抗虫亲本功能叶的 Bt蛋白含量明显地高于其上部非功能叶 ,而杂种 F1代功能叶的 Bt蛋白含量则明显地低于其上部非功能叶。盛花期后至吐絮期前 ,叶片和花瓣的 Bt蛋白表达量明显增加 ,在抗虫亲本中表现最为明显。与叶片相比 ,在花瓣中检测到的 Bt蛋白含量极低。正、反交 F1代间的 Bt蛋白表达量差异较小或无规律可循     

抗虫杂交棉F1代与亲本Bt蛋白表达量及抗虫差异性研究

对转Bt基因抗虫杂交棉正、反交F     

转基因抗虫棉Bt基因与npt Ⅱ基因的遗传与表达

采用花粉管通道法将含有Bt杀虫基因的pG4AB质粒导入受体棉花中23中,通过卡那霉素筛选,Bt免疫检测条检测,PCR扩增对转基因抗虫棉的各个自交世代进行跟踪研究。结果表明,具有卡那霉素抗性的单株能扩增出鼠基因,而且均有Bt杀虫蛋白表达。Bt基因与nptⅡ基因均整合进了棉花基因组中,相互之间紧密连锁遗传,均稳定表达,因此报告基因nptⅡ可用于研究成基因的遗传情况。     

Bt杀虫蛋白基因cry8Ea2的克隆、表达和活性

根据已知Bt cry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定.该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白.该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2.经1PTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa的蛋白.表达产物对暗黑鳃金龟.琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲具有活性,在浓度为8.98ug/s时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟一龄幼虫14 d的校正死亡率分别为46.67%和55.56%;在浓度为89.8 ug/mL时对柳蓝叶甲三龄幼虫96 h的校正死亡率为33.33%.     

转基因抗虫棉Bt基因与npt II基因的遗传与表达

采用花粉管通道法将含有Bt杀虫基因的pG4AB质粒导入受体棉花中23中,通过卡那霉素筛选,Bt免疫检测条检测,PCR扩增对转基因抗虫棉的各个自交世代进行跟踪研究.结果表明,具有卡那霉素抗性的单株能扩增出Bt基因,而且均有Bt杀虫蛋白表达.Bt基因与npt II基因均整合进了棉花基因组中,相互之间紧密连锁遗传,均稳定表达,因此报告基因npt II可用于研究Bt基因的遗传情况.     

转基因抗虫棉Bt基因的遗传连锁分析

对中美两国所获得的转基因抗虫棉品种GK— 1 2、新棉 33B分别进行了 Bt基因的连锁测验。分析表明两个品种的试验结果相似 ,Bt基因未整合在棉花第 I、II、III、IV、V、VI、VII、IX、X、XI、XII、XIII、XVII连锁群及 cu、pg、gl1等基因所涉及的染色体上。阐明了 Bt基因染色体图谱定位的复杂性 ,并提出以原位杂交技术实现 Bt基因在棉花染色体组上的物理标图     

新疆北部地区转Bt基因棉外源杀虫蛋白表达时空动态研究

 为研究新疆北部地区转Bt基因棉外源杀虫蛋白时空表达规律,2009年和2010年以中棉所43、GK62、GK19和sGK321等4个转Bt基因抗虫棉为试验材料,利用ELISA技术对其不同器官的Bt杀虫蛋白进行测定。结果表明：年度间不同转基因抗虫棉品种Bt 杀虫蛋白时空变化趋势基本一致,只是2年的Bt杀虫蛋白表达量不同,有些品种年度间差异明显;Bt杀虫蛋白含量因棉花器官的不同和棉花生育期的变化差异较大。各品种中Bt杀虫蛋白含量随棉花生育期的推进呈逐渐下降的趋势,以子叶期的子叶中的含量最高,子叶期、3叶期和7叶期的顶叶中的Bt杀虫蛋白含量明显高于现蕾期、开花期、结铃期和吐絮期的顶叶、蕾、花瓣和幼铃;棉蕾在现蕾期的Bt杀虫蛋白含量高于开花期和结铃期;花瓣在开花期的Bt杀虫蛋白含量高于结铃期。在现蕾期,顶叶中的Bt杀虫蛋白高于棉蕾;在开花期,棉蕾中的Bt杀虫蛋白含量高于顶叶,后者又高于花瓣;在结铃期,嫩叶与棉蕾中的Bt杀虫蛋白含量高于花瓣与幼铃。研究结果说明转Bt基因棉花Bt杀虫蛋白的表达水平受棉花器官种类、棉花生育期、棉花品种和种植年份的影响。     

转Bt基因棉杀虫蛋白含量时空分布及对棉铃虫产生抗性的影响

采用ＥＬＩＳＡ法（酶链免疫法）、室内初孵棉铃虫生测法和田间棉铃虫为害调查方法，研究和分析了中国构建的 Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）基因抗虫棉品系ＧＫ３和美国构建的Ｂｔ基因棉品系新棉３３Ｂ的不同生育期以及花铃期不同器官的杀虫蛋白含量、校正死亡率和田间受害率变化趋势以及它们之间的关系。结果表明，转Ｂｔ基因棉Ｂｔ杀虫蛋白含量在棉花生育过程中呈时空动态变化，在时间分布上，各生育期顶尖平展叶表现为：初花期＞蕾期、花铃期＞苗期＞吐絮期；在花铃期，各器官表现为：功能叶、茎尖＞小蕾、幼铃＞花蕊、花瓣、苞叶、老叶。室内生测幼虫校正死亡率与棉株Ｂｔ杀虫蛋白含量高度一致；田间表现与Ｂｔ杀虫蛋白含量有一定的差异，除主要受Ｂｔ杀虫蛋白影响外，棉铃虫取食选择性，以及残存高龄幼虫为害和棉株各部位营养结构等也影响其抗虫性，造成后期棉铃虫主要为害花、蕾和幼铃，两材料抗虫性表现较为一致。     

转基因抗虫小麦中sgna基因的遗传分析及抗虫性鉴定

利用基因枪介导将抗蚜虫的sgna基因导入了长江中下游地区小麦栽培品种扬麦158，得到了6棵转基因植株。PCR和RT-PCR检测分别证实了sgna基因的整合和表达。通过分析转基因植株的T1代和T2代，发现sgna基因的遗传并不符合孟德尔的遗传规律。抗蚜虫鉴定试验证明含有sgna基因的植株对蚜虫有明显的抗性，转基因植株可以显著降低蚜虫     

Bt基因在不同陆地棉基因型的表达研究

研究了Bt基因在陆地棉不同遗传背景下的表达差异。结果表明,(1)Bt基因在不同陆地棉基因型中均能充分表达,与常规(非抗虫)棉相比抗虫性极为显著。(2)不同陆地棉基因型品系(种)之间抗虫性比较,有差异且部分品系间达极显著水平。(3)Bt基因在不同陆地棉基因型的表达,前期(对二代棉铃虫的抗性)差异较大;中期(对三代棉铃虫的抗性)差异变小;后期(对四代棉铃虫的抗性)没有显著差异。(4)转Bt基因抗虫棉Bt基因的表达随棉花的生育进程呈逐渐降低趋势,即对二代棉铃虫的抗性>对三代棉铃虫的抗性>对四代棉铃虫的抗性。     

抗虫棉生长发育过程中Bt杀虫基因及其表达的变化

目前已商品化生产的国内外抗虫棉品种在生产上均存在“苗期抗性强,后期抗性减弱”的现象。从DNA、mRNA和蛋白质3个水平上对双价抗虫棉139-20 R4代植株中Bt杀虫基因及其在整个生长发育期的时空表达进行了系统研究。研究结果表明,Bt杀虫基因在抗虫棉中的表达具有时空特异性。同一组织,Bt杀虫蛋白含量在整个生长发育期呈动态     

棉不同种植年限土壤中Bt基因及其蛋白的残留测定

 从16个多年种植Bt棉花的田块抽取土壤样本。采用PCR和ELISA方法测定了土壤试样中Bt基因序列片段和杀虫蛋白的残留和累积效应。结果表明,以土壤总DNA为模板不能扩增出棉花内标准基因和cry1A基因预期大小片段。连续种植Bt 棉花可以在土壤中低剂量残留Bt杀虫蛋白,但不会导致Bt毒蛋白在土壤中累积。     

转基因水稻恢复系及其F1代Bt蛋白的时空表达分析

本研究以抗虫水稻恢复系9311(Bt)及其杂交种F1(Bt)为研究材料,以非转基因的9311为阴性对照,利用ELISA方法研究9311(Bt)及F1(Bt)各生育时期可溶性总蛋白和Bt蛋白的时空变化规律,为转Bt基因抗虫水稻的安全监管提供科学依据。结果表明：外源基因的导入没有引起水稻组织中可溶性总蛋白含量的明显变化;9311(Bt)的Bt蛋白表达量在整个生长周期的各个部位均高于相应的F1(Bt)植株;同一植株不同组织器官中Bt蛋白表达量为：叶片跃胚乳跃颖壳及茎秆跃根;同一植株不同发育期叶片Bt蛋白的测定结果整体表现为：营养生长阶段跃生殖生长阶段跃成熟衰老阶段。研究结果为转Bt基因抗虫水稻适宜检测时期的选择提供了一定的参考。     

高温胁迫对Bt棉蕾中杀虫蛋白含量及氮代谢的影响

为明确高温气候下Bt棉抗虫性下降的原因,以2个不同类型Bt棉品种为材料,2011年于盛蕾期设计38℃高温胁迫3、5和7 d;2012年设计38℃/25℃的昼夜变温胁迫4、7和10 d,研究其对转Bt棉蕾的杀虫蛋白表达量影响及其生理机理。结果表明,持续高温胁迫7 d内,棉蕾中Bt杀虫蛋白含量呈下降趋势,持续胁迫3 d内下降幅度最大,与未胁迫相比,泗抗3号和泗抗1号分别下降18.71%和26.54%;昼夜变温下高温胁迫4 d时蕾中Bt杀虫蛋白表达量无显著变化,当胁迫7 d以上时,Bt杀虫蛋白含量显著下降,泗抗3号和泗抗1号分别比对照下降11.32%和14.18%。持续高温或昼夜变温高温持续胁迫下,棉蕾中游离氨基酸含量和蛋白酶活性都显著增加,可溶性蛋白含量和GPT活性都显著下降。相关分析表明,游离氨基酸含量、蛋白酶活性与Bt杀虫蛋白含量呈极显著负相关;可溶性蛋白含量和GPT活性与Bt杀虫蛋白含量呈极显著正相关。分析表明,高温胁迫下蛋白质合成功能下降,分解能力增强导致可溶蛋白含量,包括Bt杀虫蛋白含量下降。常规种泗抗1号的抗虫性和氮代谢受高温的影响较大。