不结球白菜RAPD反应体系的优化

对影响RAPD扩增的各个因子,如TaqE,dNTP和Mg2+的浓度,模板DNA的浓度与纯度等进行研究,建立并优化了适于不结球白菜的RAPD反应体系:dNTP(0.19mmol/L)+Mg2+(1.95mmol/L)+TaqE(1U)+DNA(25ng/μL)+TM(50μmol/L)+甘油(φ=50%)+Primer(0.24μmol/L)+10×Buffer+H2O,总反应体系为25μL。     

南通市郊不结球白菜地方品种调查

不结球白菜(Brassica chinensis L.)俗称青菜,是我国南方地区主要蔬菜之一。南通的青菜有以下两个特点:一是品种类型独特,有叶形似马耳的“马耳朵”多头菜,有叶形象鸡冠而带芥菜味的鸡冠莱,还有带叶翼的绿叶镶边矮白菜等等;二是品种非常丰富,南通市郊共有青菜品种11个,除四月慢、五月慢是35年前从上海引进外,其它品种均有较悠久的栽培历史。对南通市郊青菜品种资源进行整理,使其得到更好的应用,在蔬菜周年供应中发挥更大作用,将具有重要意义。     

不结球白菜SRAP体系优化与品种聚类分析

通过单因素试验确定了Mg2+、dNTP、TaqDNA 聚合酶和引物4种因素在不结球白菜SRAP反应体系中的适宜浓度范围,并在此基础上利用正交试验设计对不结球白菜SRAP反应体系进行优化,确立了适合不结球白菜的SRAP反应体系,即25μl反应体系中,含Mg2+ 2 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、TaqDNA 聚合酶1.5 U、引物 0.36 μmol/L、1×PCR Buffer、模板DNA 30 ng.运用优化的体系,利用30个引物组合对17个不结球白菜品种进行遗传多样性的SRAP标记分析,20个多态性的引物组合共检测到90个多态性位点.应用聚类分析(UPGMA)结果显示,园艺性状相似的品种在较近的遗传距离聚类,表明SRAP可有效用于不结球白菜品种资源鉴定与聚类分析.     

不结球白菜SRAP标记体系的建立与作图亲本筛选

SRAP标记是遗传作图和分子辅助育种的重要技术之一,为了建立具有通用性的不结球白菜SRAP标记体系,选用国家种质资源重点实验室的不结球白菜作为试材,利用正交设计方法对、模板DNA、引物、Taq酶和缓冲液6个因素进行了优化,获得了不结球白菜SRAP标记反应体系的最佳组合:10 μL反应体积中包含40 ng的DNA模板、75 ng引物、0.2 mmol·L-1的的、0.15 U的Taq酶和1倍体积的缓冲液.筛选不结球白菜的作图杂交亲本是构建遗传连锁图谱的基础,以12份不结球白菜亲本为试材,利用70对SRAP引物组合共扩增出了382条多态性带,平均每个引物组合扩增出5.46条,由聚类分析图确定了杂交亲本为相似系数最小的2个组合,Q06-2和Q06--4或Q06-2和Q06-6,同时验证了SRAP标记体系的通用性.     

不结球白菜子叶离培养再生植株

用矮脚黄的子叶建立了不结球白菜高频率再生体系。在ＭＳ＋６－ＢＡ１０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．３ｍｇ／Ｌ培养基上，外植体分化率达７０％，每一外植体可产生９．６个不定芽，研究了各种因素对子叶离体再生植株的影响，发现１１－１５ｄ苗龄的子叶分化效果最佳。ＭＳ＋ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ对根的诱导最好。     

不结球白菜耐盐品种筛选

研究了我国目前广泛栽培的30个不结球白菜品种种子萌发期的抗盐性,以期筛选出适合盐碱地种植的不结球白菜品种。采用水培的方法,测定了各品种在盐胁迫下的相对发芽率、相对胚芽长、相对胚鲜质量、相对胚根长和相对根毛区宽度等指标(各指标的相对值为盐处理与去离子水培养的比值),在此基础上分析各指标的隶属函数值,计算耐盐指数。结果表明,30个不结球白菜耐盐性差异较大,耐盐指数位于前3位的品种分别为四倍体矮脚黄(0.93)、秦白二号(0.68)和北京小杂56(0.61),改良605耐盐指数最低(0.05)。从耐盐等级分析结果可以看出,四倍体矮脚黄为高耐品种,秦白二号、北京小杂56两个品种为耐盐品种,郑研小包23、上海鸡毛菜、丰抗90等10个品种为中等耐盐品种,美味四季小白菜、郑白小包头、新优抗70、精品四月白等14个品种为盐敏感品种,而日本绿宝、改良605和矮抗青等3个品种为高感品种。     

仁用杏‘围选1号’雌蕊总蛋白双向电泳体系的建立

为了建立一套适合仁用杏‘围选1号’雌蕊蛋白质分析的双向电泳系统,对总蛋白质的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、上样量、IPG胶条梯度进行了优化。优化的条件为:酚-甲醇/醋酸铵沉淀法提取总蛋白质,浓度为12%的SDS-PAGE凝胶,24cm pH 4～7的IPG胶条,上样量100μg,采用该体系能获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,基本满足仁用杏‘围选1号’雌蕊蛋白质的分析和研究。     

优质不结球白菜新品种暑绿的选育

通过分子标记辅助选择技术获得矮脚黄自交不亲和系,以其为母本,苏州青自交系为父本,选育出优质、抗病的新品种暑绿。其特点为:(1)优质:叶片与叶柄质量比为0.67,高于对照品种;维生素C含量211.4～219.0mg·kg-1,干物质6.18～6.64g·100g-1(鲜重),可溶性蛋白质0.39～0.41g·100g-1(鲜重),可溶性糖19.95～21.41g·100g-1(干重),均优于对照;粗纤维7.52～8.04g·100g-1(干重),低于对照。(2)抗病:对炭疽病、TuMV、霜霉病和黑斑病进行人工接种鉴定,病情指数分别为5.98(HR)、17.20(R)、16.06(R)和13.96(R)。(3)丰产:区试试验的平均产量为85.30t·hm-2,比对照品种绿星增产5.0%;生产试验的产量为143.37t·hm-2,比绿星增产37.7%。     

优质不结球白菜新品种暑绿的选育

通过分子标记辅助选择技术获得矮脚黄自交不亲和系,以其为母本,苏州青自交系为父本,选育出优质、抗病的新品种暑绿.其特点为:(1)优质:叶片与叶柄质量比为0.67,高于对照品种;维生素C含量211.4～219.0 mg·kg-1,干物质6.18～6.64g·100g-1(鲜重),可溶性蛋白质0.39～0.41 g·100g-1(鲜重),可溶性糖19.95～21.41 g·100g-1(干重),均优于对照;粗纤维7.52～8.04g·100g-1(干重),低于对照.(2)抗病:对炭疽病、TuMV、霜霉病和黑斑病进行人工接种鉴定,病情指数分别为5.98(HR)、17.20(R)、16.06(R)和13.96(R).(3)丰产:区试试验的平均产量为85.30 t·hm-2,比对照品种绿星增产5.0%;生产试验的产量为143.37 t·hm-2,比绿星增产37.7%.     

不结球白菜苏州青子叶离体分化

以不结球白菜品种苏州青的子叶为外植体 ,研究了苗龄、培养基、生长调节剂与硝酸银浓度等因子对其不定芽分化频率的影响。结果表明 ,在MN +TDZ (2mg·L-1) +NAA (0 5mg·L-1)条件下 ,苏州青的子叶分化率最高 ,达36 7% ;最佳苗龄为 7d ;硝酸银的最佳质量浓度为 7 5mg·L-1。     

不结球白菜小孢子胚胎发生过程及发育途径研究

采用FDA荧光染色法对小孢子游离培养的发育过程进行了观察。结果表明:不结球白菜花粉母细胞减数分裂释放出的小孢子发育到单核靠边期及稍后时期染色最深、活力最强。多数游离小孢子培养经历的发育过程与合子胚相似,并且胚胎发育迅速,6～9 d产生大量球型胚,13 d开始出现子叶型胚胎。小孢子胚胎发育途径既有对称分裂并产生胚胎的途径(B途径),也有第1次不对称有丝分裂的方式;第1次不对称分裂后,既有营养细胞单独发育成胚的现象(A途径),也有营养细胞和生殖细胞共同发育成胚的现象(E途径),但未发现生殖细胞单独发育成胚的现象。     

不结球白菜离体培养再生体系的优化

为了筛选较易再生的不结球白菜品种,为转基因工作建立良好的再生体系,以暑绿、苏州青、亮白叶和矮抗5号为材料,研究了基因型、外植体类型以及不同的激素配比对再生频率的影响.结果表明不同品种中,暑绿的再生频率最高.不同外植体类型中,子叶-子叶柄再生频率最高.种子发芽培养基中添加苯基噻二唑基脲(TDZ)使幼苗生长健壮,利于外植体分化,不定芽分化率均在60.00%以上,子叶-子叶柄在培养基MN 0.5 mg·L-1 TDZ 0.5 mg·L-1 NAA 7.5 mg·L-1 AgNO3中再生频率最高,达到80.00%,表明TDZ在诱导器官的发生中有较强的持续效应.     

不结球白菜S位点受体激酶基因片段的克隆与表达分析

以不结球白菜自交不亲和系03的基因组DNA和柱头cDNA为模板,利用引物SRKF/SRKR扩增获得长度为964 bp和646 bp的SRK基因片段。序列比较分析表明,克隆的基因片段属于SRK基因的激酶域,该序列包含4个外显子和3个内含子,编码215个氨基酸,与芜菁、甘蓝、芥蓝等SRK基因有90%以上的相似性。荧光定量PCR分析结果表明:自交不亲和系03和自交亲和系105不同组织中SRK基因的表达水平存在显著的差异,SRK基因主要在自交不亲和系的柱头中高度表达,自交亲和系中该基因的表达主要分布于叶片、花蕾和柱头组织中。     

不结球白菜L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因(GLDH)cDNA片段克隆与RNAi表达载体构建

根据植物中hpRNA(hairpin RNA)原理,选择GLDH基因cDNA序列同源性较低区域设计1对携带双酶切位点的特异引物,以不结球白菜‘苏州青’叶片为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了GLDH基因片段。构建中间克隆载体,经过3次亚克隆将测序正确的GLDH基因片段分别以正向和反向两种形式插入到间隔基因YYT的两端,经鉴定已插入到植物表达载体中,成功地构建了干扰GLDH基因表达的RNAi植物双元表达载体pRNAi-GLDH,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,为深入研究GLDH基因功能提供有效的工具。     

不结球白菜品种（株系）对炭疽病抗性的鉴定与筛选

报道不结球白菜对炭疽病 (Colletotrichumhigginsianum) 抗性的苗期鉴定方法和抗病品种 (株系 )的筛选结果。在 2片真叶期 ,以 1× 10 6个·mL-1孢子浓度喷雾接种 ,2 5℃、RH >10 0 %保湿 2 4h ,2 5℃光照培育 7d ,可快速地将不同抗性的品种 (株系 )鉴别出来。用该方法所获得的品种 (株系 )抗性鉴定结果与田间苗期 (5片真叶期 )和成株期抗性鉴定结果基本一致。将该方法与田间抗性鉴定相结合 ,从 2 6个品种 (株系 )中筛选出 4个高抗材料 ,可供生产上使用或作为抗病育种的抗源材料     

白菜核雄性不育两用系AFLP扩增特异片段的克隆及序列分析

利用AFLP技术从白菜核不育两用系"矮脚黄"可育系DNA中得到一个特异扩增片段MF-14.Southern杂交结果证实不育系也存在该片段的同源序列;回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-T Easy载体进行序列测定.测序结果表明,该片段全长289 bp,其碱基组成为A+T=46.02% .与白菜RAPD特异片段S107及其他育性相关基因核苷酸序列比较,同源性均低于50% .表明该片段为一新的序列.     

二、四倍体不结球白菜子叶再生能力及其与内源激素的关系

以6个同源四倍体和2个二倍体不结球白菜（Brassica campestris ssp．chinensis Makino）的子叶为外植体,正交设计筛选不定芽诱导优化培养基,测定二、四倍体不结球白菜子叶内源生长素IAA（吲哚-3-乙酸）和细胞分裂素ZR3（玉米素核苷类）的含量及ZRs／IAA比值大小,探讨再生能力与内源激素的相关性。结果表明：四倍体不定芽再生率变化范围是33．4％-83．3％,2个二倍体材料的最高再生率分别是33．3％和80．3％。四倍体白菜内源激素ZRs和IAA含量高于其相应二倍体白菜。用2种方法确定四倍体材料再生能力与内源激素含量的相关性,结果表明再生能力与ZRs／IAA比值显著相关,相关系数分别为0．9428和0．8857。     

小白菜线粒体DNA提取体系的建立

为了建立小白菜线粒体DNA(mtDNA)提取体系,以小白菜黄化苗为材料,研究了不同提取方法、材料选择等因素对线粒体DNA提取的影响。结果表明,经冰浴研磨小白菜黄化苗,通过简易的密度梯度离心技术快速抽提大量高纯度的线粒体,蛋白酶K裂解线粒体及有机溶剂抽提去除蛋白质,可获得纯度较高的mtDNA,能用于RAPD分析。     

青梗、优质、抗热同源四倍体白菜杂交新品种暑优1号的选育

采用秋水仙素诱变二倍体青梗白菜早油冬，获得四倍体白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）；将其与另两个四倍体苏州青和热优2号的亲本R1杂交，从后代中筛选出两个形态及生理特性差异明显的株系，分别育成自交不亲和系，用这两个自交不亲和系配制成F1代杂交种，即获得青梗、优质、抗热的同源四倍体白菜杂交新品种－－暑优1号。