农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T1代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L~(-1) KT、0.5 mg·L~(-1) 6-BA和0.05 mg·L~(-1) NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L~(-1)的IBA的SM1(无其他生长素)的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L~(-1) CuSO4显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T0代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T1代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

抗除草剂转基因水稻和大豆快速准确检测技术研究

以实验室培育的转基因水稻和大豆为研究材料,对含草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene,bar)和不与草甘膦结合的突变型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因(5-enolpyruvylshi-kimate-3-phosate synthase gene,EPSPS)2种不同除草剂筛选标记的转基因植株进行叶片喷涂、叶片离体平板培养、种子萌发试验,以建立快速、准确的转基因鉴定方法,并探索可有效区分转化和非转化植株鉴定用的筛选剂剂量.结果表明:这3种方法都能快速、简便、准确地鉴定相应的转基因植株;水稻和大豆叶片对农药吸收具有一定的差异,用300或135 mg/L草铵膦可有效区分是否转入bar基因,用1％或0.25％农达喷施可区分是否转入EPSPS基因;用含有50 mg/L草甘膦的平板培养离体大豆叶片可以方便地区分出转基因株系;种子萌发对除草剂剂量十分敏感,用远低于10 mg/L的2种除草剂即可有效区分阳性与阴性种子.本研究建立的快速鉴定转基因植株的方法在转基因研究材料的鉴定及转基因安全评估中具有重要意义.     

矮牵牛‘梅林’遗传转化体系的建立

在矮牵牛‘梅林’再生体系基础上,建立根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系,以获得转PSARK-IPT基因的矮牵牛植株。结果表明,转化效率最高的预培养时间为2d,农杆菌侵染浓度为OD600=0.5,侵染时间为3min;共培养时间为36h;适宜的抑菌抗生素头孢霉素浓度为500mg·L~(-1);潮霉素作为遗传转化中的筛选标记,选择2mg·L~(-1)为叶片分化筛选压,4mg·L~(-1)的Hey为最佳生根筛选压。对获得的15株潮霉素抗性植株进行PCR及RT-PCR检测,证明7株为阳性,证实目的基因已整合到这7株矮牵牛基因组中。     

转Bt基因欧洲黑杨转化TA29-Barnase基因的研究

为了获得雄性不育转Bt基因欧洲黑杨,在以叶片为外植体建立转Bt基因欧洲黑杨叶片组培再生体系的基础上,利用农杆菌介导叶盘法将TA29-Barnase基因转化到转Bt基因欧洲黑杨中。结果表明,转Bt基因欧洲黑杨叶片不定芽分化最适培养基为:MS+0.5 mg·L~(-1) 6-BA+0.05mg·L~(-1) NAA+0.01mg·L~(-1) TDZ+30g·L~(-1)蔗糖+6g·L~(-1)琼脂;不定芽生根最适培养基为:1/2MS+0.05mg·L~(-1) NAA+0.2mg·L~(-1) IBA+20g·L~(-1)蔗糖+6g·L~(-1)琼脂;经过在叶片不定芽诱导及生根诱导培养基添加除草剂PPT连续筛选,共获得9株抗性植株。对抗性植株进行基因特异性PCR检测,其中有5株呈阳性,转化阳性率达55.6%。初步表明获得了转Barnase基因的转Bt基因欧洲黑杨植株。     

以nptⅡ为选择标记基因的转基因小麦高效筛选方法

采用两种方法筛选以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦植株,结果表明,由未成熟种子获得的植株在无菌条件下进行卡那霉素筛选时（A方法）,50 mg/L的卡那霉素能有效抑制非转化小麦幼苗的正常生长;由成熟种子自然发芽获得的植株在滤纸上进行卡那霉素滴注筛选时（常规方法,B方法）,80～100 mg/L的卡那霉素能较好地抑制非转化小麦幼苗的正常生长。相对于B方法的常规筛选方法,A方法具有材料对卡那霉素敏感性高、筛选周期短而且筛选结果可靠性高等优点,是一种高效的以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦的筛选方法。     

番茄遗传转化与筛选鉴定的改进研究

将At-pri-miR828基因的过表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828通过农杆菌侵染法转入番茄(Solanum lycopersicum L.)品种‘Ailsa Craig’为例,来对番茄的遗传转化过程中番茄种子消毒处理、无菌苗培养、转基因阳性植株的Kan筛选浓度、PCR检测等方法进行研究,旨在探索一套快速高效的番茄遗传转化及鉴定方法。研究发现:采用C_2H_5OH、Na_3PO_3及NaClO分别浸泡及无菌水反复冲洗的种子消毒方法,可使污染率减少到5%以下;种子震荡培养法可以提高发芽率并促进种苗的生长势一致;筛选转基因阳性植株的Kan最佳质量浓度为100mg·L~(-1);100mg·L~(-1)的Kan溶液浇灌蛭石和在MS培养基中添加Kan的方法都可以用来筛选转基因番茄。最终Kan筛选和PCR检测等鉴定方法显示番茄的遗传转化效率为32.5%。     

抗除草剂转基因玉米的快速鉴定方法

以含不与除草甘膦结合的突变型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因除草剂筛选标记的转基因玉米为材料,通过叶片喷雾和叶片离体平板培养等试验,建立快速非分子生物学抗除草剂转基因玉米的鉴定方法。结果表明:用5 000 mg/L草甘膦叶片喷雾和用70 mg/L草甘膦叶片离体培养可快速准确地鉴定是否转入除草剂基因。     

Cd胁迫对不同类型小麦幼苗生长及光合生理特性的影响

为探讨不同类型小麦对镉(Cd)胁迫的耐受机制,以蓝黑粒和商麦1619为材料,采用水培法,研究不同Cd浓度(0 mg·L~(-1)、25 mg·L~(-1)、50 mg·L~(-1)、75 mg·L~(-1)和100 mg·L~(-1))对小麦幼苗生长和光合生理特性的影响。结果表明:(1)随着Cd浓度的增加,小麦幼苗株高、根长、根系干重和地上干重呈现先增后减的变化趋势;(2)叶绿素含量、净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)随着Cd浓度增加显著下降;综合来看,蓝黑粒较商麦1619表现出较强的Cd耐受能力。     

甾烯醇原药对小麦黄矮病的毒力测定及防效试验

黄矮病在世界各地小麦上发生普遍,在田间是由麦蚜传播小麦黄矮病侵染引起发病,对我国小麦危害损失严重,生产上急需有效的低残留的防治药剂。为了明确甾烯醇对作物病毒病的防治水平,实验室提取制备了甾烯醇原药,对小麦黄矮病的毒力测定和田间防效进行了试验。毒力测定结果表明甾烯醇原药对小麦黄矮病的有效抑制中浓度(LC_(50))为3.385 mg·L~(-1),田间试验结果表明,喷施15 mg·L~(-1)甾烯醇原药稀释液2d后接种病毒,相对预防效为82.63%,接种病毒2 d后喷施15 mg·L~(-1)甾烯醇原药稀释液,甾烯醇处理区大多数植株健壮、叶片绿色,少数植株发病,治疗效果为76.16%,说明植物源甾烯醇可用于黄矮病的绿色防控。     

基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定

【目的】获得转KN2基因的小麦植株,为研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用,以及为利用基因工程提高小麦抗逆性奠定基础。【方法】以弱冬性小麦品种小偃22为供试材料,通过基因枪法,用含有KN2基因的植物表达载体和筛选标记基因bar共转化小麦幼胚愈伤组织,经过除草剂(Phosphinothricin,草丁膦)筛选和愈伤组织分化获得再生植株,并对得到的再生小麦植株进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击小偃22的幼胚愈伤组织1 680个,共获得再生植株17株,移栽到花盆中成活15株;根据目标基因序列设计特异引物,对成活的小麦植株进行PCR检测,结果表明获得含有bar基因和KN2基因的转基因阳性植株分别为6株和4株,转化率分别为0.36%和0.24%,bar和KN2的共转化率为0.24%。【结论】KN2基因成功地转入到小麦品种小偃22中。     

外源ALA对Ca(NO -3) -2胁迫下生菜植株的缓解效应及品质的影响

探讨适合缓解(CaNO_3)_2胁迫下生菜生长的最适5-氨基乙酰丙酸(ALA)浓度,为ALA在相关园艺作物上的应用与推广提供依据和参考。以"美国大速生"生菜为材料,采用水培法栽培进行试验,分别用10mg·L~(-1)、30 mg·L~(-1)和50 mg·L~(-1)三个浓度进行筛选。结果表明,10 mg·L~(-1)的ALA增加了生菜植株地上和地下部分的干、鲜重,并且提高了SOD和POD的活性,显著降低了生菜叶片中硝酸盐和脯氨酸的含量,但是对生菜叶片中Vc的含量影响不显著。三个浓度中,10 mg·L~(-1)的ALA较适合缓解生菜受到的盐胁迫。     

抗逆转基因旱稻转化体系的优化

以粳糯型常规旱稻品种"冀旱糯3号"为受体材料,利用农杆菌转化法将bar基因和lea-1基因转入旱稻细胞,建立了适用于旱稻的高效转化体系,最终获得转基因植株,并对转基因植株进行PCR检测。结果表明:当农杆菌浓度(以D_(600 nm)表示)为0.2时,转化效果最好。在筛选抗性愈伤时,除草剂的最佳浓度为40 mg/L,对抗性愈伤组织进行预分化能提高其分化率,对转基因植株进行分子检测,优化后的转化率提高到37.5%。     

不同植物生长调节剂对复合盐胁迫下黑小麦种子萌发的影响

【目的】探讨α-萘乙酸钠(NAA)、赤霉素(GA_3)和6-苄氨基嘌呤(6-BA)3种植物生长调节剂不同质量浓度对不同程度盐胁迫条件下黑小麦种子萌发的影响,为在盐渍地区种植黑小麦提供可能性和科学依据。【方法】以紫麦一号的种子为试验材料,采用纸床法分别测定不同质量浓度的3种植物生长调节剂对不同程度盐胁迫条件下黑小麦种子萌发的影响。【结果】在无盐胁迫条件下,NAA、GA_3、6-BA质量浓度分别为150 mg·L~(-1)、GA_3 200 mg·L~(-1)和6-BA 5 mg·L~(-1)时,黑小麦种子的发芽率、发芽势等萌发指标均为最佳;复合盐(NaCl∶Na_2SO_4=1∶1)溶液浸种显著抑制了黑小麦种子的萌发;用不同质量浓度的植物生长调节剂预处理均可在一定程度上缓解复合盐胁迫对黑小麦种子萌发的抑制作用;在中低浓度(40～80 mmol·L~(-1))复合盐胁迫条件下,GA_3 200 mg·L~(-1)和6-BA 5 mg·L~(-1)预处理均能有效缓解复合盐胁迫对种子萌发的影响;随着复合盐浓度的增加,各处理种子的发芽势和发芽率明显下降,当复合盐浓度为120 mmol·L~(-1)时,只有6-BA 5 mg·L~(-1)预处理对缓解胁迫有一定作用。【结论】在中低复合盐浓度胁迫条件下,采用GA_3(200 mg·L~(-1))或6-BA(5 mg·L~(-1))预处理能够缓解盐胁迫对黑小麦种子的伤害,从而显著促进在盐胁迫条件下黑小麦种子的萌发。     

农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T₁代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L^-1 KT、0.5 mg·L^-1 6-BA和0.05 mg·L^-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L^-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L^-1 CuSO₄显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T₀代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T₁代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

杜氏盐藻电击转化体系的优化

[目的]构建盐藻高效遗传转化体系,以利于在细胞内组装靶标代谢途径,进而以盐藻为生物反应器规模化生产类胡萝卜素、生物燃油等高值产品。[方法]以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为受体,以来源于高油植物斑鸠菊(Vernonia galamensis)编码DGAT酶的基因VgDGAT1a为靶基因,以pCAMBIA3301为表达载体,利用电击法进行遗传转化,优化转化条件和相关参数,并对转化体进行分子检测。[结果]杜氏盐藻对除草剂草铵膦敏感,固体和液体培养筛选阳性转化体的草铵膦浓度分别为20mg·L~(-1)和40mg·L~(-1)。优化的盐藻电转化技术条件包括:培养7d的藻细胞为受体,质粒浓度6mg·L~(-1),电击参数为0.4kV和4ms。盐藻转化率达2.63‰,比现有转化效率提高约1.14倍。分子检测显示靶基因VgDGAT1a基因成功转入杜氏盐藻并高效表达。[结论]建立的优化电击转化方法显著提高了盐藻转化效率,在高等植物遗传转化中,常用的抗除草剂草铵膦Bar基因可用作盐藻基因转化的选择标记,植物表达载体pCAMBIA3301亦可用于盐藻遗传转化。     

苯达松对轮叶黑藻生理特性的影响

随着水体污染的日趋严重,水生植被特别是沉水植被的衰退和消失是世界范围内的普遍现象,为探究其退化与除草剂的相关性,采用水培试验方法,研究不同浓度苯达松对轮叶黑藻植株叶绿素含量和2种抗氧化酶活性,以及丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(SP)及脯氨酸(Pro)含量的影响。结果表明,苯达松可以抑制轮叶黑藻叶绿素a的合成,促进叶绿素b的合成(除4.0mg·L~(-1)处理外),叶绿素总量随苯达松浓度增加而下降,降低了植物体光合能力;在试验浓度范围内,过氧化物酶(POD)活性先升高后降低,超氧化物歧化酶(SOD)活性在0.1,0.2,1.0 mg·L~(-1)处理呈先升后降的趋势,而在0.5,2.0,4.0 mg·L~(-1)处理及CK呈降低-升高-降低的趋势;处理后第10天,随着苯达松浓度的增加,轮叶黑藻体内丙二醛(MDA)含量先升后降,至0.5 mg·L~(-1)达到最高,可溶性蛋白(SP)含量显著下降,而脯氨酸(Pro)含量显著升高。上述结果均说明苯达松影响了轮叶黑藻正常的生理代谢活动。     

转Chi-Glu基因野罂粟植株卡那霉素筛选技术

为探索卡那霉素(Kan)抗性筛选在转基因野罂粟上的应用,以含有几丁质酶(Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(Glu)的双价基因的T0代转基因野罂粟种子为试验材料,进行卡那霉素叶喷、叶片涂抹试验,筛选卡那霉素的最佳浓度;对T1代转基因植株进行卡那霉素筛选,并用PCR检验其阳性植株。结果表明:培养皿幼苗最佳叶喷浓度为50 mg/L;土培苗最佳叶喷和涂抹浓度为6.5g/L,连续叶喷或涂抹5d,每天1次。经卡那霉素筛选共获得12株转基因野罂粟植株,通过PCR检测,有4个株系已将Chi-Glu双价抗病基因整合进野罂粟的基因组中。     

芦笋茎尖遗传转化体系的建立与优化

通过优化根癌农杆菌 EHA105(含有pBI121表达载体)介导的茎尖遗传转化条件,包括抑菌抗生素类型及浓度、农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间、卡那霉素浓度等影响因素,建立芦笋品种‘达宝利’遗传转化体系。以0.1～0.3 cm长的芦笋茎尖为转化受体,用MS液体培养基(MS+蔗糖3%+乙酰丁香酮150μmol·L~(-1))悬浮菌体至OD_(600)为0.6,侵染茎尖15 min,20℃避光共培养4 d;抗性茎尖在筛选培养基(1/2 MS+IBA 0.5mg·L~(-1)+KT 0.1mg·L~(-1)+嘧啶醇0.5mg·L~(-1)+羧苄青霉素200mg·L~(-1)+卡那霉素50mg·L~(-1))上诱导长芽与生根,可获得抗性植株,经PCR、 GUS组织化学染色和qRT-PCR检测,获得阳性植株。     

卡那霉素筛选小麦转基因后代方法的优化

[目的]优化卡那霉素筛选小麦转基因后代的方法。[方法]以普通去离子水和0.5×Hoangland营养液为卡那霉素(Kan)的溶解介质,对Kan的浓度进行多梯度筛选,确定Kan的最低有效浓度,并针对不同小麦基因型材料进行验证。[结果]0.5×Hoangland营养液是Kan的理想溶解介质,既降低了Kan对小麦幼苗生长的抑制作用,又提高了Kan的筛选效果。30 mg/L是Kan作用于小麦NC221的最低有效浓度。不同小麦基因型对Kan的敏感性稍有不同,对大多数小麦基因型来说,Kan的最低有效浓度为30~45 mg/L,即在该浓度范围内进行处理可除去90%的未转基因植株。[结论]0.5×Hoangland营养液作溶解介质时,Kan用于筛选小麦转基因后代的最低有效浓度为30~45 mg/L。     

蝴蝶兰高效再生体系与遗传转化体系的建立

为建立蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)再生体系和遗传转化体系,对蝴蝶兰进行人工授粉,成熟后将胚播种于诱导培养基上诱导原球茎或不定芽。探讨外源调节剂的种类及浓度,并筛选卡那霉素浓度以及除菌剂的种类及浓度。结果表明:当6-BA浓度为5 mg·L~(~(-1)),NAA浓度为1 mg·L~(-1)时,原球茎的诱导效率最高。当6-BA浓度为1.5mg·L~(-1),同时添加0.5g·L~(-1)活性炭和40mL·L~(-1)椰汁时,壮苗效果最佳。卡那霉素的筛选浓度为4mg·L~(-1),除菌剂的种类为阿莫西林克拉维酸钾(7∶1),除菌浓度为100mg·L~(-1)。