猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对外周血单个核细胞凋亡细胞因子mRNA表达的影响

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductine and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用real-time PCR技术对外周血单个核细胞(PBMC)中的病毒栽量以及Fas、FasL、TNFR1和TNF-α等凋亡细胞因子mRNA表达水平进行检测,采用流式细胞术对PBMC的凋亡比率进行检测.结果显示,PRRSV/PCV2共感染组PBMC中PRRSV和PCV2载量、PB-MC凋亡比率均显著高于PRRSV感染组或PCV2感染组.所有病毒感染组的Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的mRNA表达水平均显著上调,并且PRRSV/PCV2共感染组的表达水平均显著高于单感染组.结果表明,Fas/FasL、TNFR1/TNF-α表达水平的显著上调可能在PRRSV和PCV2协同诱导凋亡机制中扮演重要角色.     

PCV2、PRV、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)有关基因序列,通过序列比对及参考相关文献,设计了3对特异性引物。通过优化,建立了可同时检测PCV2、PRV及PPV 3种病毒的多重PCR方法。结果表明,该方法能同时检测到PCV2、PRV及PPV的最低核酸量分别为40pg、72pg、46pg。对猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细环病毒(TTSuV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)无扩增。应用该方法对87份临床样品进行检测,PCV2阳性检出率为28.7%(25/87),PRV野毒检出率为11.5%(10/87),PPV检出率为12.6%(11/87)。其中2种以上病毒混合感染阳性率为13.8%(12/87),3种病毒同时感染的阳性率为2.3%(2/87),其结果也与单一PCR结果一致。研究结果提示,该方法可用于PCV2、PRV、PPV三种病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。     

PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)的三重PCR方法,根据Gen Bank登录的病毒相关基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为192 bp(PRV)、255 bp(PCV2)和759 bp(PPV)。对PRV、PCV2和PPV的核酸检测最低浓度分别为:2.5×10-2,2.2×10-3和3.7×10-2ng,证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。应用该方法对56份临床样品进行检测发现,PRV、PCV2和PPV的阳性率分别为16.1%、50.0%和19.6%,二重感染率为12.5%,三重感染阳性率为3.6%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有效手段。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）与猪圆环病毒2型（PCV2）共感染40日龄健康大白仔猪，利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞（PAM）共刺激分子CD80一CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明，在感染后第3d和第7dCD80与CD86mRNA转录显著下调（P〈0．05），感染后第14dCD86mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80mRNA转录水平在第14d和第28d高于对照组，CD86mRNA转录水平在第28d高于对照组，两者在第42d均高于对照组，但无显著差异。证实，PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制，PAM的抗原呈递能力受到影响。     

猪圆环病毒2型感染对猪CD80和CD86 mRNA表达的影响

通过构建猪共刺激分子CD80和CD86的缺失cDNA竞争分子,用竞争PCR技术定量检测了猪圆环病毒2型(PCV2)感染后猪肺泡巨噬细胞(PAM)中CD80和CD86的mRNA水平,分析了PCV2感染对猪共刺激分子CD80和CD86的mRNA表达的影响.结果显示,PCV2感染后,PAM中CD80和CD86的mRNA水平变化趋势一致,只是CD86的升降幅度更大.在PCV2感染后3d,CD80与CD86的mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至14d达到高峰,尔后快速下降,21d及以后恢复正常.本研究结果表明,PCV2初期可明显抑制猪共刺激分子CD80和CD86的基因转录.     

PPV VP2基因与PCV2 ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性

为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPV VP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPV SC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、C(A:117～131aa,B:157～183aa,C:165～200aa)和PPV VP2基因。将A、B、C基因分别与PPV VP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPV VP2蛋白和PCV2ORF2抗原表位的重组质粒pCI-A-VP2、pCI-B-VP2、pCI-C-VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4+/CD8+细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI-B-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。     

四川省PPV与PCV2的病原流行病学调查

从四川省21个规模化猪场采集样品273份,利用PCR方法检测并分析了猪细小病毒和猪圆环病毒的感染及混合感染情况,结果共检出PPV病原阳性样品47份（占17．22％）;PPV阳性猪场8个（占38．1％）;种猪的感染率较高,仔猪感染率相对较低;检出PCV2病原阳性样品143份（占52．38％）,PCV2阳性猪场18个（占85．7％）;PCV2感染随猪年龄的增长而升高;检出PPV和PCV2混合感染样品29份（占10．62％）;同时存在PPV和PCV2的猪场6个（占28．7％）,混合感染主要集中在母猪和保育仔猪阶段。仅有3个猪场未检出PPV和PCV2病原,占14．3％。该结果说明PPV与PCV2及其混合感染在四川省流行广泛,对养殖业构成了较严重的危害。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对外周血单个核细胞促炎细胞因子mRNA表达的影响

将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV2）单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用Real-ti me PCR技术对外周血单个核细胞（PBMC）中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎细胞因子的mRNA表达进行定量分析。结果表明,病毒感染后,PRRSV感染组、PCV2感染组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平均上调,其中PRRSV感染组的IL-6、IL-8显著上调,PCV2感染组的IL-6、IL-8和TNF-α显著上调;PRRSV/PCV2共感染组仅有IL-8和TNF-α的mRNA表达水平上调且差异显著;并且,PRRSV/PCV2共感染组IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达水平均低于单独感染组,仅TNF-α的mRNA表达水平显著高于单感染组。结果提示,TNF-α的过量表达可能在PRRSV和PCV2协同致病机制中扮演重要角色。     

TaqMan-MGB多重荧光定量PCR检测PCV2、PCV3和PCV4方法的建立和应用

为建立一种可同时鉴别致病性猪圆环病毒(PCV)不同基因型的检测方法,本试验针对PCV2、PCV3和PCV4的ORF2基因保守区域设计引物和探针,将人工合成目的基因与质粒连接,构建阳性质粒PCV2-ORF2、PCV3-ORF2和PCV4-ORF2。通过优化引物浓度、探针浓度、退火温度等参数,建立PCV2、PCV3和PCV4 TaqMan-MGB多重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法对38份临床样品进行应用检测,对24个养猪场(户)进行流行病学调查。结果显示,建立的方法能特异性区分PCV2、PCV3和PCV4,且与其他常见猪病病原不发生交叉反应;对PCV2、PCV3和PCV4的最低检出浓度分别为1.56×10、1.28×10和1.76×10拷贝/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性好;38份临床样品中PCV2、PCV3和PCV4阳性样品分别为17、3和1份,从24个养猪场(户)采集的689份样品中PCV2、PCV3和PCV4阳性率分别为33.33%、12.50%和8.33%。结果表明,本试验建立的PCV2、PCV3和PCV4 TaqMan-M...     

PMWS患病猪群中PCV2与CSFV、PPV、PRRSV混合感染的调查

应用套式PCR方法对采自辽宁、河北、河南、湖北、湖南、山东、浙江、福建和广西9个省份的733份临床发病猪肺脏和淋巴结样品进行了PCV2的检测,然后对鉴定为PCV2阳性的283份病料再分别进行PRRSV、PPV和CSFV的检测,以确定猪群中PCV2与CSFV、PRRSV和PPV双重感染情况,结果表明:CSFV、PRRSV和PPV阳性样品分别为74份、94份和46份,阳性率分别为26.1%、33.2%和16.3%。表明这些地区发病猪群中PCV2与这三种病毒的双重感染普遍存在,其中以PCV2和PRRSV的双重感染较为突出;但在河北和湖北两省,则以PCV2与CSFV的双重感染为主。     

猪细小病毒感染PK-15细胞抗病毒相关因子转录变化的分析

为了解猪细小病毒(PPV)感染后引起干扰素及其相关细胞因子的反应,探讨宿主一病毒之间的作用关系,作者运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞引起的病毒DNA量的变化和细胞因子IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR 2、MHC-I、MHC一Ⅱ、MX1、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF-3的转录水平.结果显示,PPV感染PK-15细胞12h病毒开始大量迅速增殖,48 h达到最高峰;PPV感染后可引起PK-15细胞中IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-I、MHC-Ⅱ、Mxl、iNOS、2-5AS、RNase I.和IRF-3的转录量显著增加,其中Mχ1基因在24 h转录量达到8 423倍.猪细小病毒感染可引起PK-15细胞抗病毒相关因子转录增加.     

非洲猪瘟病毒诱导猪红细胞凋亡并促进猪外周血单核细胞的吞噬作用

本研究旨在探讨非洲猪瘟病毒（ASFV）对猪红细胞（RBCs）的作用以及对猪外周血单核细胞（PBMs）吞噬能力的影响。试验采用流式细胞术检测ASFV侵染猪原代肺泡巨噬细胞（PAMs）和猪红细胞（RBCs）的能力,并检测ASFV诱导RBCs发生凋亡的百分比;同时采用激光共聚焦试验（Confocal）观察ASFV诱导RBCs发生凋亡是否影响PBMs的吞噬能力。结果显示,ASFV不能入侵RBCs,但以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡。0.1 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导1.27%、3.23%、7.39%和8.56%的RBCs发生凋亡;1 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导1.54%、3.73%、8.46%和10.74%的RBCs发生凋亡;3 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导2.65%、5.01%、12.44%和18.61%的RBCs发生凋亡。同时,凋亡的RBCs可以增加PBMs对黄绿色荧光微球的吞噬数量,ASFV诱导RBCs凋亡的百分比越高,PBMs吞噬黄绿色荧光微球的数量越多。综上所述,ASFV不能侵染猪RBCs,但可以以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡并增强PBMs的吞噬功能。     

一例猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

本试验采用多重PCR方法,对来检于贵州省清镇市某猪场送检病料进行猪病毒性疫病的病原快速检测,诊断结果表明该例患病猪为猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 3种病毒的混合感染。     

我国猪圆环病毒病2型疫苗及相关联苗的研究进展

猪圆环病毒(PCV)能刺激机体产生中和性抗体,但该病毒体外增殖能力差,培养物病毒含量低,病毒接种细胞不产生病变等特性使传统的灭活疫苗、弱毒疫苗的生产受到了局限。通过对我国相关专利的分析,发现我国许多研究机构及学者在驯化和筛选适应PCV2生长的细胞系、构建重组病毒株、建立高密度培养技术等方面做了大量工作以期规避这些弊端,并开展了PCV2相关的二联苗、三联苗的研发工作,以有效预防PCV2及相关性疾病的发生。     

猪圆环病毒2型感染PK-15细胞中外泌体的鉴定及其对细胞增殖和凋亡的影响

旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子（CD81、TSG101）;PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30~200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显（P<0.01）,外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）;PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。     

猪圆环病毒2型不对称PCR检测方法的建立

为研究制备单链DNA的方法,根据GenBam已发表的PCV-2全基因组序列,设计合成2条特异性引物和1条通用引物,通过pGM-T-PCV-2重组质粒的构建、引物浓度优化、单链PCR产物的杂交测序鉴定,以及敏感性和特异性试验,对PCV-2不对称PCR方法进行了研究.结果显示,上、下游引物用量比为20:1～40:1时,可明...     

低血清培养PK-15细胞及其增殖猪圆环病毒2型的研究

依次采用含60、30、20、10mL/L血清浓度的低血清培养基驯化PK-15细胞,并给驯化好的细胞上接种猪圆环病毒2型(PCV-2),以确定PCV-2在该培养体系下的生长情况。结果用含60、30、20mL/L血清浓度的低血清培养基各进行3代次驯化,PK-15细胞能完全适应且生长状态良好;当血清浓度降至10mL/L时,传代1次细胞无法保持良好状态,细胞出现贴壁较差、生长停滞等现象。各血清浓度培养体系中细胞生长曲线测定结果显示,在细胞培养的0、24、48、72、96h各组细胞密度与常规培养的对照组差别不明显。因此用该低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种PCV-2后,通过荧光抗体染色测定病毒滴度。结果显示,低血清培养的PCV-2病毒滴度为10~(6.5)TCID_(50)/mL,与常规条件培养的PCV-2对照(病毒滴度为10~(6.375 )TCID_(50)/mL)差别不明显,表明该体系可用于PCV-2的增殖。表明研究建立了PK-15细胞低血清培养PCV-2体系,为PCV-2的相关研究奠定了基础。     

Detection of Porcine Circovirus Type 2, Porcine Parvovirus and Porcine Pseudorabies Virus from Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome by Multiplex PCR

Multiplex PCR was established to detect porcine circovirus type 2 (PCV-2), porcine parvovirus (PPV) and porcine pseudorabies virus (PRV) and applied to samples from 137 piglets exhibiting clinical signs of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). PCV-2 DNA was detected from all samples. Moreover, 43 samples were positive for PPV but negative for PRV; 11 samples were positive for PRV but negative for PPV; and 35 samples were positive both for PPV and PRV. These results suggests that PCV-2 co-infection with PRV and PPV may play an important role in PMWS. Also, multiplex PCR is an appropriate candidate method for diagnosis of PCV-2, PRV and PPV simultaneously in field cases.