猪内源性反转录病毒5＇非编码区启动子活性的分析

[目的]构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5＇＇非编码区（5＇＇UTR）为启动子的萤光素酶表达载体,分析5＇＇UTR的转录调控规律.[方法]将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达.[结果]缺失R区的5＇＇UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5＇＇UTR启动子活性显著下降.UTR显示出较之LTR强的启动子活性.缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强.[结论]在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性.在5＇＇UTR的下游序列中,包括引物结合区（PBS）和前导序列（Leader）可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5＇＇UTR的转录活性.     

猪内源性反转录病毒5''非编码区启动子活性的分析

[目的]构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5'非编码区(5'UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5'UTR的转录调控规律.[方法]将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达.[结果]缺失R区的5'UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5'UTR启动子活性显著下降.UTR显示出较之LTR强的启动子活性.缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强.[结论]在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性.在5'UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5'UTR的转录活性.     

广西巴马小型猪内源性反转录病毒进化年代分析

【目的】确定广西巴马小型猪内源性反转录病毒（PERV-BM）的进化年代。【方法】对先前扩增、测序获得的 9个PERV-BM的LTRs,一个PERV-BM全长基因组序列,登录号为HM159246及GenBank上发表的所有背景清楚的猪内源性反转录病毒（PERV）的LTRs及env序列进行分析。首先利用DAMBE软件对上述序列比对分析,合并同源性较高的,筛选有差异代表性的核酸序列的数据集。然后利用MEGA5.2软件Neighbor-Joining方法计算PERV-BM遗传进化关系。利用DAMBE软件对上述筛选的序列集进行替换饱和度计算,分析核酸进化速率的稳定性;利用MEGA5.2软件,通过最大相似法对筛选数据制作的遗传进化树进行分子钟行为分析。最后对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析,对符合分子钟行为的LTRs序列,以假设的恒定进化速率计算PERV-BM的进化年代。【结果】经过DAMBE软件分析后,选出80多个GenBank上发表的有代表性的env、LTRs序列数据集。对PERV-BM (HM159246) 序列全长遗传进化分析显示,PERV-BM与中国的PERV核酸序列EF133960和GU980187,荷兰的AF356697亲缘关系较近,与韩国的HQ540595和美国的AF038600和NC_003059亲缘关系则较远。利用DAMBE软件对筛选数据集替换饱和度检测结果显示,S和V值随PERV序列之间进化分歧的增加呈线性的增加。LTRs序列数据集替换饱和曲线呈线性关系,没有替换饱和现象发生,LTRs的进化随时间持续且稳定。数据集env序列替换饱和曲线不完全呈线性关系,表明env序列集进化速率不稳定。利用MEGA5.2的最大相似法对LTRs和env数据集的进化树进行分子钟行为检测结果显示,LTRs序列集接受分子钟假说,env进化不符合分子钟行为,这和不饱和度检测的结果一致。因此可用LTRs进化的近分子钟行为进行PERV进化年代的计算。利用DAMBE软件对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析结果显示,3′-LTR的进化符合分子钟行为可用于进化年代计算。假设以灵长类ERV的积累突变率,每个核苷酸每年的替换率2.3×10^-9-5.0×10^-9,计算PERV-BM约进化于3.3×10⁶-7.1×10⁶年前。【结论】PERV-BM进化年代与欧洲小型猪PERV进化时间7.6×10⁶年前相近。     

猪瘟病毒3′非编码区的多态性及其二级结构分析

【目的】分析CSFV3′-UTR一级序列和二级结构,为研究其对病毒复制、增殖和毒力的关系奠定良好的基础。【方法】利用RT-PCR技术扩增CSFV Thiverval株、HCLV株和Shimen株的3′-UTR并测序,使用DNAstar、Sequencher和RNAstructure软件进行CSFV3′-UTR基因组序列的比对分析和二级结构模拟。【结果】Thiverval株3′-UTR最长可达259个碱基,与母源株Alfort相比,含有32nt的插入,最短只有233个碱基,含有6nt的插入。HCLV株最长有244个碱基,含有17nt的插入;最短有233个碱基,含有8nt的插入。同时,疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型和自由能发生改变,自由能随着插入片段的增加而升高。【结论】(1)CSFV3′-UTR存在两个高度变异的区域。(2)CSFV疫苗株Thiverval株和HCLV株3′-UTR同一样品不同克隆株中插入片段呈现明显的不均一。(3)疫苗株的插入片段影响3′-UTR二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。     

野猪·家猪及其杂种猪ACSL4基因3′UTR区多态性分析

[目的]为猪的分子育种研究提供理论依据。[方法]采用酚-氯仿法从野猪、民猪、大白猪、长白猪、杜洛克和杂种猪的耳组织中提取基因组DNA,根据GenBank上猪ACSL4基因cDNA全序列设计3对引物,进行PCR-SSCP和测序,分析ACSL4基因3UTR区的多态性。[结果]3对引物中,仅K3引物的PCR-SSCP产物有多态性,检测到3种基因型(AA、BB和AB)。在ACSL4基因3′UTR区3862 bp处发生T→C碱基突变。仅在大白猪、长白猪,杜洛克和杂种猪中发现多态性位点,而在民猪和野猪中未发现。杜洛克、大白猪和杂种猪间不同基因型的分布都有极显著差异(P<0.01),长白猪和大白猪各基因型的分布无显著差异(P>0.05)。[结论]该研究为丰富猪种的种质特性资料库和充分利用种质资源提供了依据。     

洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡禽内源性反转录病毒基因检测与分析

为了解禽内源性反转录病毒(AERs)在湖北地方鸡种洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组中的存在状况,利用禽内源性反转录病毒EAV、ev loci和ev/J特异性引物对两种鸡的基因组进行PCR检测。结果表明,洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡中均检测出EAV、ev loci和ev/J三种禽内源性反转录病毒基因序列;核酸序列同源性分析显示,洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组中的EAV、ev loci和ev/J之间的同源性分别为98.8%,99.6%和99.6%;进化树分析显示,两种鸡内的三种禽内源性反转录病毒均分别位于进化树的同一分支,表明洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡内源性反转录病毒具有共同的祖先并且进化路径相似。洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡的ev/J与ALV-J原型株HPRS-103同源性高于98%,且进化树处于同一分支。而与ALV-J国内分离株SD9901、YZ9901毒株的同源性较低,并且进化树位于不同分支,表明这两种鸡的ev/J可能与ALVJ原型株HPRS-103亲缘关系更近,而与国内的外源性ALV-J分离毒株SD9901、YZ9901亲缘关系较远。     

鸡端粒酶反转录酶启动子区克隆及序列分析

根据GenBank(AY505015)报道的鸡端粒酶反转录酶序列设计了1对特异性引物,以鸡淋巴瘤细胞(MDCC-MSB1)总核酸为模板进行PCR。PCR产物连接到pMD19-T载体进行测序,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索,并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得MDCC-MSB1启动子区全长为997 bp,其中G C占50.78%。与国外报道的端粒酶反转录酶(AY505015)启动子区序列同源性为99.22%。与人端粒酶反转录酶启动子区相比:二者在起始密码子之前约250 bp均有1个E-box,但在chTERT启动子区新增加了4个c-Myb位点,而3个c-Ets2和WT1位点缺失,其他基序二者的分布基本相似。二者启动子区富含CpG岛,延伸到编码区。     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至+7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含“GC“碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至 7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因“F3′5′H”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F3′5′H”在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98．55％。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与“F3′5′H”构建成能够在植物中进行道传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4非编码区启动子活性的研究

应用PCR方法亚克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物 (BananabunchytopvirusChineseZhangzhouisolate ,BBTV ZZ)DNA 4非编码区 (Po1)、主要共同区缺失片段 (Po2 )和主要共同区及茎环共同区都缺失片段 (Po3) ,分别插入到植物表达载体pCAMBIA 130 4的gfp::gus基因上游 ,替代椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S) ,得到重组质粒pTA2、pC2 6和pC45 .通过Agroinfiltration法 ,将含pTA2、pC2 6、pC45和pCAMBIA 130 4的根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtu mefaciens)注射进烟草 (NicotianatabacumL .cv .XanthiNC)叶片 ,进行 β 葡糖苷酸酶 (GUS)和绿荧光蛋白 (GFP)含量的瞬间表达分析 .含有pTA2、pC2 6、pC45、pCAMBIA 130 4和未注射的烟草叶片其GUS活性分别为 1 0 0 7、0 85 2、0 939、2 0 6 9和 0 0 2 1pmol·MU (μg·min) ;间接酶连免疫试验 (ELISA)结果表明每毫克总蛋白中的GFP于 490处的吸收值 (A490 )分别为 89 5 77、6 5 184、72 0 96、10 0 4 40和 3 2 87.以上表明Po1、Po2和Po3具有较强的启动子活性 .此外 ,转基因烟草的GUS组织化学定位检测试验进一步表明Po1、Po2和Po3具有维管组织特异性 .     

食源性肥胖小鼠IRX3基因5′UTR区甲基化率研究

为了研究食源性肥胖小鼠腹部脂肪组织中IRX3基因5′UTR区甲基化情况及IRX3基因mRNA表达情况,将雄性C57BL/6J小鼠进行食源性肥胖造模,采用RT-qPCR法检测IRX3 mRNA表达情况,BSP(Bisulfite sequencing PCR,BSP)法检测IRX3基因5′UTR区甲基化情况。结果表明,肥胖组小鼠腹部脂肪组织IRX3基因相对表达量极显著高于对照组(P0.01);小鼠腹部脂肪组织IRX3基因5′UTR区甲基化率差异不显著,但有2个位点(-128 bp和-116 bp处)和1个位点(-182 bp处)的甲基化率在所有肥胖小鼠中分别达到62.5%、62.5%和75.0%,极显著高于其他位点。小鼠发生食源性肥胖,IRX3基因mRNA表达上调;食源性肥胖小鼠腹部脂肪组织IRX3基因表达上调与其5′UTR区甲基化率无关;食源性肥胖小鼠腹部脂肪组织IRX3基因5′UTR区3个特异位点的甲基化,可能参与了肥胖的发生。     

湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒的检测及亚型分析

为探明湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒携带情况及病毒亚型分布,应用gag,pol特异性引物,对31头湖南沙子岭猪耳部组织的DNA,RNA样品进行了PCR,RT-PCR检测,依据env基因表型env-A,env-B,env-C,鉴定了每头猪携带PERV亚型．结果表明,在所检31头个体中,93．5％的个体基因组中同时有PERV的A,B2种亚型（记为env-AB）,另外6．5％的个体基因组中则同时有PERV的A,B,C3种亚型（记为env-ABC）,所有个体的耳样组织中均未检测到单独存在的PERV的A,B或C亚型．说明湖南沙子岭猪中存在PERV序列,且能以mRNA的形式表达,病毒亚型以env-AB为主．     

广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

[目的]克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础.[方法]通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性.[结果]发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个CpG岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段.成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05).[结论]成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段.     

内源性禽白血病病毒ev／J gp85基因的表达

从已构建的质粒pGEM-MTCgp85中酶切回收ev／Jgp85基因,通过构建杆状病毒转移载体pFast-Bacl-ev／Jgp85和重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ev／Jgp85,将ev／Jgp85基因转入Bac-to-Bac高效真核表达系统的Sf9昆虫细胞进行真核表达。间接免疫荧光试验显示,构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞出现与野生型杆状病毒感染的Sf9细胞阴性对照明显不同的亮绿荧光;Western blot分析DAB显色,重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35ku的阳性条带。结果表明,内源性ev／Jgp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达,并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别。     

不同猪种乳铁蛋白基因启动子区单核苷酸多态性分析

通过构建DNA池和测序,分析了广东蓝塘猪、大花白猪和外来长白猪3个猪种的乳铁蛋白基因启动子区和部分5'UTR区1 494 by的单核苷酸多态性.结果表明,在3个猪种中发现了24处单核苷酸突变,其中12处为转换,8处为颠换,3处为插人.1处为缺失突变.通过生物信息学方法预测了猪乳铁蛋白基因启动子转录因子结合位点,发现了5个SNP:-1032A>G、-989C>T、-740T>G、-732G缺失、-680A>G,分别位于PEA3、cAMP、STAT5、SRY转录因子结合位点上,其中-1032 A>G产生了MYTI结合位点,-680A>G导致了SRY结合位点消失,引起了转录因子结合位点的改变,但是否对启动子转录活性有影响还需要进行深人研究.     

猪HIF-1α基因启动子区及编码区的生物信息学分析

利用生物信息学方法,对NCBI中公布的猪缺氧诱导因子HIF-1α基因的5′端上游2 000 bp长度的候选启动子区进行了核心启动子及转录结合位点的预测;同时对其所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、高级结构及进化关系进行了分析。结果显示：猪HIF-1α基因5′端上游存在潜在启动子区,存在CpG岛,存在多个转录因子结合位点,编码的蛋白为亲水性蛋白;蛋白质等电点为5.11,共由824个氨基酸组成,含量最高的为亮氨酸。HIF-1α蛋白主要定位于细胞核内,不存在跨膜结构域,为非跨膜蛋白,不存在信号肽,二级结构主要为α-螺旋及无规卷曲。此外通过对猪HIF-1α基因序列的同源性比较发现,与猪HIF-1α基因同源性最近的是绵羊,同源性最远的是原鸡。此研究为猪HIF-1α基因结构和功能的探索提供了一定的理论依据。     

水牛 STAT5a 和 STAT5b 基因启动子克隆及其活性分析

为了解转录激活与信号转导因子5(STAT5)在水牛乳腺发育及泌乳生理中的功能,对水牛STAT5a和STAT5b基因的5′调控区启动子序列进行了克隆,并比较其活性.根据GenBank已公布的牛STAT5a和STAT5b基因序列设计特异性引物,以广西本地水牛乳腺组织基因组DNA为模板,通过PCR法分别扩增不同长度STAT5a和STAT5b基因启动子片段并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的水牛STAT5a基因启动子片段(P1和P2)大小是500bp,700bp,STAT5b基因启动子片段(P3,P4和P5)大小是500bp,800bp,1 500bp.在线分析结果显示,仅P2片段中存在高甲基化位点,且富含SP1,AP2等转录因子结合位点.将构建的不同长度启动子片段分别连入pGL3-Basic载体,分别转染水牛乳腺上皮细胞,检测荧光素酶表达水平.与未转染组相比,P1~P5质粒转染组的荧光素酶比值均显著提高(p0.05);添加5mg/mL质量浓度催乳素(PRL)处理乳腺上皮细胞,P3质粒转染组的荧光素酶比值显著高于其他各组(p0.05).以上结果表明,水牛STAT5a和STAT5b基因启动子活性均受到PRL调节,两者表达水平在水牛乳腺上皮细胞中不同,且STAT5b基因表达受PRL调控更为明显.     

牛MYOZ1基因启动子活性分析

【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。     

角蛋白启动子荧光素酶表达载体的构建及其表达活性分析

角蛋白14(K14)和角蛋白5(K5)主要在毛囊基质和复层鳞状上皮基底层的角质细胞里表达。这两个启动子已被广泛应用于毛囊特异表达外源基因的转基因小鼠模型的研究中,为了能将其应用于转基因绵羊生产,探讨基因对绵羊毛囊发育的影响,从人基因组中克隆得到K14和K5启动子,利用不同的报告基因在细胞水平分析各启动子的表达活性。结果表明,这两个启动子在不同细胞系中都能驱动外源基因的表达,而且K14启动子在小鼠皮肤细胞系JB6-C41中的表达活性高于其他细胞。