甜菜夜蛾生物钟基因Per和Tim的分子克隆及昼夜表达动态

针对重要农业害虫甜菜夜蛾,通过序列相似性分析从转录组数据获得2个生物钟基因片段,利用RACE技术进一步克隆了cDNA全序列,分别命名为SexiPer和SexiTim。2个基因编码的氨基酸序列和已报道的昆虫同源序列具有较高的相似性,其中SexiPer和海灰翅夜蛾、甘蓝夜蛾的相似性最高,分别为71%和52%;SexiTim和家蚕、柞蚕的相似性最高,分别为65%和52%。进化分析表明,Per基因的氨基酸序列相似性与昆虫间的亲缘关系非常一致,但Tim基因不太一致。进一步利用qRT-PCR技术,对雄蛾触角中2个基因的昼夜表达动态进行了测定,发现2个基因表达量的变化同步,均在光期前期较低,光期后期开始升高,至光期末期达到最高,并在整个暗期保持较高水平。研究认为,甜菜夜蛾触角中可能存在着生物钟,用于调控性信息素通讯的昼夜节律。     

甜菜夜蛾触角气味受体基因OR18的克隆和表达定位

【目的】从甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）成虫触角中克隆气味受体基因,研究受体基因在虫体不同组织和触角不同感受器中的表达分布,从而探讨受体基因的功能。【方法】通过PCR结合RACE技术克隆气味受体基因的全长序列,利用实时定量PCR检测其在不同组织中的表达,采用原位杂交确定其在触角不同感受器中的分布。【结果】通过同源克隆的方法从甜菜夜蛾触角中获得1条740 bp的基因片段,通过RACE技术获得全长序列并命名为SexiOR18（GenBank登录号JN873314）。SexiOR18 cDNA全长1 618 bp,开放阅读框长度为1 194 bp,编码398个氨基酸。序列比对和进化树分析结果显示SexiOR18与其它鳞翅目昆虫尤其是夜蛾科昆虫的OR18具有很高的相似性。实时定量PCR检测结果显示,SexiOR18主要在成虫触角中表达,且在雌虫中的表达量显著高于雄虫,SexiOR18在成虫其它组织和幼虫触角中无明显表达。原位杂交结果显示,SexiOR18主要在毛形感器和锥形感器下表达,而在腔锥形感器和刺形感器下没有表达。【结论】SexiOR18在感受性信息素和普通气味的毛型感器和锥形感器中都有分布,推测其可能参与了性信息素和普通气味分子的识别。     

甜菜夜蛾U6 snRNA的克隆及其表达稳定性分析

U6 snRNA是真核生物主要剪接体的重要组分,在不同物种中保守且表达水平稳定。为评估甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)U6 snRNA是否适合作为miRNA(microRNA)定量表达检测内参基因,本研究通过克隆甜菜夜蛾U6 snRNA全长序列,分析其进化保守性及与其他物种U6 snRNA的系统进化关系,并进一步探究除虫菊提取物、高温培养和甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus, SeMNPV)感染胁迫下U6 snRNA的表达稳定性。结果表明,克隆的甜菜夜蛾U6 snRNA全长107 nt。多序列比对和系统进化分析表明,不同物种U6 snRNA具较高保守性,甜菜夜蛾U6 snRNA与其他鳞翅目昆虫的系统进化关系最近。利用终浓度为LC₅₀的除虫菊提取物或36℃高温培养胁迫处理Se301细胞,以及SeMNPV感染甜菜夜蛾幼虫(72 h),U6 snRNA均表达稳定。研究结果可为甜菜夜蛾miRNA表达检测内参基因的选择提供依据。     

斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及表达

【目的】克隆斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）基因,分析其序列特征,为深入研究该基因奠定基础。【方法】利用RACE末端快速扩增技术,在斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆TCTP基因的全长。根据不同物种间TCTP基因的同源性来构建进化树,并在原核细胞中对斜纹夜蛾TCTP进行表达。【结果】克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,登录号为HQ896486.1。序列分析表明,该基因cDNA全长829 bp,开放阅读框长519 bp,编码含172个氨基酸的蛋白,蛋白分子质量19.67 kD。生物信息学分析表明,斜纹夜蛾TCTP基因属于受翻译控制肿瘤蛋白家族,与其它物种TCTP基因有很高相似性。构建重组质粒 pET32a(+)-TCTP,在大肠杆菌中表达重组蛋白,确定了1 mmol•L-1 IPTG诱导4 h为重组蛋白表达的最佳条件,在短期内能得到大量稳定性好的TCTP蛋白。【结论】从斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,并且成功在原核细胞中进行表达。本研究为深入研究斜纹夜蛾TCTP的功能以及针对斜纹夜蛾TCTP基因RNAi干扰的生物防控提供了理论依据和技术支持。     

甜菜夜蛾核多角体病毒Se62基因的克隆与结构分析

[目的]克隆并分析甜菜夜蛾核多角体病毒（却odoptera exigua muhicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）ORF62全长基因（Se62）。[方法l采用PCR的方法扩增Se62基因,将其克隆至pMDl8．T载体上,获得了重组质粒T．5e62,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为1128bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列（No．NC_002169）核苷酸同源性100％。序列分析表明,Se62基因编码蛋白（SE62）存在明显的跨膜区域,有多个蛋白激酶c、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N．糖基化位点。蛋白序列比对结果表明,SE62属于杆状病毒P48蛋白超级家族成员,与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa califorica muhicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）P48蛋白的同源性为52％,其在病毒复制中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se62基因,为研究其在病毒复制中的功能奠定了基础。     

甜菜夜蛾核多角体病毒Se29基因的克隆与序列分析

[目的]克隆得到甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exiguamulticapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）ORF29全长基因（Se29）。[方法]用PCR的方法扩增Se29基因,将其克隆至pMD18-T载体上,获得了重组质粒T-Se29,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为642 bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列（Genbank accession No.NC002169）核苷酸同源性100%。序列分析结果表明,Se29基因编码蛋白（SE29）存在一个可能的跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,1个微体C末端靶信号位点。蛋白序列比对结果表明,SE29与棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovir-us,HaSNPV）ORF128（Ha128）的编码蛋白（HA128）具有较高的同源性,其在病毒侵染过程中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se29基因,为研究其在病毒侵染过程中的作用奠定了试验基础。     

应用RNA干扰技术对甜菜夜蛾信息素结合蛋白功能的研究

采用RNA干扰技术,通过腹腔注射法将甜菜夜蛾信息素结合蛋白1(SexigPBP1)双链RNA导入雄蛾体内,48 h后定量PCR检测表明,SexigPBP1的mRNA表达量被敲减90%以上;同时,触角电位(EAG)测定结果表明,注射处理48 h后雄蛾对雌蛾性信息素主组分Z9,E12-14∶Ac的EAG反应降低了约60%,证明SexigPBP1在雄蛾对该组分的感受中起重要作用.     

2个甜菜夜蛾信息素结合蛋白cDNA片段的克隆和序列分析

 通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的信息素结合蛋白（PBP）氨基酸序列，设计合成一对简并性引物, 利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)雄虫触角扩增得到2个分别为275 bp和281 bp的cDNA片段SexigPBP1和SexigPBP2，其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成。通过在GenBank中进行序列的同源性比较，表明这2个序列与已知几种昆虫的PBP氨基酸序列具较高同源性。     

甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究

【目的】在昆虫中,几丁质的合成对于其生长发育至关重要,虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比较深入,但是在昆虫中,目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面,而对于通路上其他基因的研究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP）对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。【方法】以甜菜夜蛾5龄第1天幼虫的cDNA为模板,通过简并引物扩增出甜菜夜蛾UAP基因（SeUAP）的中间片段,然后利用特异性引物和RACE技术扩增出3′和5′ race序列,拼接得到cDNA全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA,并通过RT-PCR方法分析SeUAP在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射dsUAP观察其生长状况,检测RNAi的效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp的SeUAP cDNA,编码一个491个氨基酸残基的蛋白,与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的UAP亲缘关系较近。该基因在表皮和卵巢中大量表达,在气管和中肠中的表达次之,在马氏管中表达微弱,在脂肪体中则基本检测不到其转录本的存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达,在卵的整个阶段、L22（幼虫2龄第2天）、L31、L42、L51、P0、P5、P7以及A3这些天中的表达量较高,其余天数表达量较低,其表达的高峰主要出现在几丁质需求量较高的时期。RNAi结果表明,通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射5 µg dsRNA,导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡,并出现两种畸形现象：（1）虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化,但头部蛹壳形成有障碍,化蛹时无法突破旧表皮;（2）虫体头部蛹壳形成正常,也能正常突破旧表皮,但蜕皮过程仅到此为止,无法正常进行下去。定量PCR结果显示SeUAP的沉默对几丁质合成酶A基因（SeCHSA）下调不明显,而对几丁质合成酶B（SeCHSB）的表达有明显下调作用。【结论】UAP可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一定作用。     

甜菜夜蛾在汝南县花生上的发生情况及防治对策

近年来,农业种植业快速的发展,给种植户带来了丰厚的收入。同时农作物上的主要病虫害在汝南都有不同程度发生,尤其是甜菜夜蛾,近几年在我县花生上呈逐渐加重发展趋势,危害也日益加重。     

Biology,invasion and management of the agricultural invader: Fall armyworm,Spodoptera frugiperda(Lepidoptera: Noctuidae)

The fall armyworm(FAW), Spodoptera frugiperda(J. E. Smith), is native to the Americas. It has rapidly invaded 47 African countries and 18 Asian countries since the first detection of invasion into Nigeria and Ghana in 2016. It is regarded as a super pest based on its host range(at least 353 host plants), its inherent ability to survive in a wide range of habitats, its strong migration ability, high fecundity, rapid development of resistance to insecticides/viruses and its gluttonous characteristics. The inherently superior biological characteristics of FAW contribute to its invasiveness. Integrated pest management(IPM) of FAW has relied on multiple applications of monitoring and scouting, agricultural control, chemical pesticides, viral insecticides, sex attractants, bio-control agents(parasitoids, predators and entomopathogens) and botanicals. Knowledge gaps remain to be filled to:(1) understand the invasive mechanisms of S. frugiperda;(2) understand how to prevent its further spread and(3) provide better management strategies. This review summarizes the biological characters of FAW, their association with its invasiveness and IPM strategies, which may provide further insights for future management.     

甜菜夜蛾多酚氧化酶的特性及其对曲酸等抑制剂的反应

 以甜菜夜蛾5龄幼虫为试材提取多酚氧化酶,经40%饱和度硫酸铵沉淀、SephadexG-100凝胶过滤等步骤部分纯化后,总活力回收率为26.67%,酶活力提高8.56倍。以邻苯二酚为底物,测得该酶反应的最佳条件:pH=6.5,T=40℃,米氏常数Km=10.73mmol·L-1。研究了曲酸、香草酸等5种化合物对该酶活力的影响,结果表明,除芦丁外均对其酶活力产生一定的抑制作用,其中以曲酸抑制力最强,其抑制中浓度I50为36.71g·ml-1。曲酸对该酶活力的抑制动力学研究表明,该化合物是典型的可逆竞争型抑制剂,     

甜菜夜蛾天敌的研究进展

对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)的天敌种类,包括捕食性天敌、寄生蜂、寄生蝇、病原线虫、微孢子虫、病原真菌、细菌和病毒等及其应用进行了综述,并就当前应用中存在的问题及解决方法进行了探讨.     

莱氏野村菌不同菌株生物学特性及其对甜菜夜蛾的毒力

以分离自鳞翅目甜菜夜蛾[ Spodoptera exigua (Hübner)]、斜纹夜蛾[Prodenia litura( Fabriciu)]和银纹夜蛾(Argyrogrmma agnate)罹病虫体的3个莱氏野村菌(Nomuraea rieyi)菌株NY-LE01、NY -PL02和NY -AA00为材料,研究了各菌株的生长速度、产孢量、萌发率、抗旱力及对甜菜夜蛾3龄幼虫的毒力.结果表明,菌株NY-LE01菌落生长速度、产孢量、培养24h的孢子平均萌发率及抗旱能力明显高于NY-PL02和NY-AA00菌株.菌株NY-LE01、NY-PL02和NY-AA00对甜菜夜蛾幼虫的侵染致病毒力回归方程分别为Y=2.53 +0.46X(r =0.936),Y=3.67 +0.21X(r =0.942),Y=2.78 +0.31X(r =0.892);各菌株对甜菜夜蛾幼虫的LC50(孢子/mL)分别为(2.342 ±0.132)×105、(2.154±0.215)×106和(1.450±0.21)×107孢子/mL.在1.26×105～1.26 ×108孢子/mL接种处理后,各菌株对甜菜夜蛾幼虫的LT50估计值范围分别为5.6～7.8、6.2 ～9.9和7.5 ～10.3 d.表明菌株NY-LE01对甜菜夜蛾具有较强的毒力,可作为甜菜夜蛾生防制剂开发的菌株.     

食物因素对甜菜夜蛾生长发育及繁殖的影响

本文报道了生菜、豌豆、辣椒作为食物对甜菜夜蛾生长发育及繁殖的影响。3个食物组幼虫历期之间有显著差异，其中生菜组历期最短（12．21d），辣椒组幼虫历期最长（17．98d）；雌蛹历期辣椒组与其余两组差异显著，生菜组与豌豆组无显著差异，其中辣椒组雌蛹历期最长（11．28d），生菜组最短（9．62d）。3组间雄蛹历期差异均显著，其中辣椒组最长（13．06d），生菜组最短（10．41d）。雌蛹蛹重3组间差异均显著，其中辣椒组最轻（55．73mg），生菜组最重（83．11mg）。雄蛹蛹重辣椒组显著低于其余两组，另两组间无显著差异，其中辣椒组最轻（52．50mg），生菜组最重（72．29mg）。雌蛾寿命、产卵量、卵块孵化率辣椒组均显著低于其余两组，另两组无显著差异，其中生菜组雌蛾寿命最长（12．47d），产卵量最大（637粒），卵块孵化率最高（86．76％），辣椒组雌蛾寿命最短（9．81d），产卵量最少（431．5粒），卵块孵化率最低（56．61％）。为此，作者认为生菜、豌豆比辣椒更适合于甜菜夜蛾的生长发育和繁殖，主要与食物中可溶性糖与粗蛋白的比例有关。     

Population occurrence of the fall armyworm,Spodoptera frugiperda(Lepidoptera: Noctuidae), in the winter season of China

Fall armyworm(FAW), Spodoptera frugiperda(J.E. Smith), has become an important pest in Chinese agricultural systems since its invasion on 11 December 2018. After its establishment, FAW months in the year-round breeding region have become the main source population migrating to other areas in China. Field investigations were conducted in tropical and subtropical regions to improve understanding of its year-round breeding area in China. The results showed that FAW larval density was significantly correlated with the seasonal temperature of the location surveyed. The FAW larvae maintained a high density in the tropical area and were frequently found in sites of the south subtropical region, but were absent from the north subtropical region and the northern part of the central subtropical region. These results indicated that FAW can reproduce annually in the tropical and south subtropical regions of China, including Hainan, Taiwan and the southern area of Fujian, Guangdong, Guangxi, Guizhou, and Yunnan. Hence, great effort should be made to monitor and control FAW in the year-round breeding region to suppress the population density of this area and to reduce migration of moths into northern parts of China. This study clarifies the occurrence area of the pest in winter in China and provides much valuable information for its population forecasting and management.     

温湿度和幼虫饥饿胁迫对白僵菌毒杀甜菜夜蛾效果的影响

为了研究温、湿度和饥饿胁迫对白僵菌防治甜菜夜蛾幼虫的影响,进行了室内试验。结果表明:温度对白僵菌的致病力有显著影响,24～27℃下有利于白僵菌感染甜菜夜蛾幼虫;湿度对白僵菌的致病力也有显著影响,高湿环境有利于白僵菌感染甜菜夜蛾幼虫;饥饿胁迫能显著缩短甜菜夜蛾幼虫被白僵菌杀死的时间。因此,在利用白僵菌防治甜菜夜蛾幼虫时,只有充分考虑温、湿度等天气因素,害虫的食物摄取,幼虫虫龄等基本情况,才能取得最佳的防治效果。     

甜菜夜蛾双重氧化酶基因SeDuox的克隆、表达及功能分析

【目的】昆虫双重氧化酶（dual oxidase,Duox）介导产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）是调节昆虫肠道微生物动态平衡的重要免疫机制。本研究通过分析甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）双重氧化酶基因（SeDuox）的序列特征与表达模式,RNAi技术探究SeDuox基因沉默对甜菜夜蛾肠道细菌载量的影响,分析SeDuox对苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）的免疫响应,从而明确SeDuox在昆虫肠道免疫调控中的作用,为甜菜夜蛾的综合防控提供新的思路和作用靶标。【方法】利用反转录PCR（RT-PCR）技术克隆SeDuox,序列特征进行生物信息学分析,采用ClustalX和MEGA_X软件构建系统发育树;克隆SeDuox膜外91—1 767 bp编码基因SeDuox-OM,利用Bac to Bac表达系统构建Bacmid-SeDuox-OM,脂质体转染法转染昆虫细胞Sf9,表达SeDuox-OM膜外蛋白;采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法分析甜菜夜蛾不同组织（围食膜、血淋巴、脂肪体、马氏管、中肠和表皮）和不同发育时期（卵、1—5龄幼虫、雌蛹、雄蛹）SeDuox的表达水平;利用RNAi技术进行功能分析,向4龄幼虫注射SeDuox的dsRNA,以注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的dsRNA作为对照,注射48 h和72 h后检测基因沉默效果及肠道细菌载量的变化;向甜菜夜蛾幼虫饲喂Bt,RT-qPCR方法分析SeDuox及相关免疫基因的诱导表达情况。【结果】SeDuox序列全长为4 497 bp,编码1 498个氨基酸,预测蛋白质的相对分子量为171.62 kD。SMART分析结构域发现SeDuox含有过氧化物酶结构域（peroxidase）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结构域（NAD）、N-端钙离子结合域（EFH）、铁还原酶结构域（Ferric）和黄素腺嘌呤二核苷酸结构域（FAD）,与斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等昆虫的Duox结构域类似。TMHMM分析显示有7个跨膜区,跨膜片段SeDuox-OM 在昆虫细胞中成功表达约80 kD的重组蛋白;RT-qPCR分析结果显示SeDuox在甜菜夜蛾4龄幼虫不同组织中均有表达,其中围食膜和中肠表达量较高;在不同发育时期均有表达,但在卵期表达量最高。与注射dsGFP相比,注射 dsSeDuox 的甜菜夜蛾幼虫在48 h和72 h时,SeDuox表达量分别下调了62.08%和74.94%,肠道微生物载量显著升高。甜菜夜蛾幼虫取食Bt GS36 48 h时,SeDuox表达量显著增加,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点。【结论】甜菜夜蛾SeDuox具有保守的结构域,在中肠和围食膜中高表达,SeDuox在宿主肠道免疫调控中起重要作用,可能与抗菌肽基因协同作用抵御Bt的侵染。     

上海地区甜菜夜蛾的抗药性及防治

通过浸渍法测定上海地区甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)对有机磷、拟除虫菊酯类、昆虫生长调节剂类(IGRs)以及一些新型药剂的抗性,结果表明:甜菜夜蛾对乙酰甲胺磷和氰戊菊酯的抗性分别为2 731.2和619.5倍的超高抗水平。昆虫生长调节剂如抑太保、米满等药剂对甜菜夜蛾抗性表现较好,是防治甜菜夜蛾的理想药剂,但近几年的敏感性有所下降,应注意抗药性抗性的产生和加剧。田间药效与室内毒力测定结果显示趋势一致。除尽、安打、氟铃脲、甲胺基阿维菌素苯甲酸盐和病毒制剂等是目前防治甜菜夜蛾的良好药剂。     

草地贪夜蛾幼虫龄期的划分

为明确草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼虫龄期,以便快速准确识别幼虫虫龄,为其预测预报以及防治策略制定提供依据,本试验采用多功能体视显微镜对草地贪夜蛾各龄期幼虫的头长、头宽、体长和体宽进行测定,并利用Origin 9.0和SPSS Statistics 20.0软件对4项指标进行分析.结果表明:...