银杏叶绿素a/b结合蛋白基因(GbLhcb4)及其启动子克隆

为了探究银杏中叶绿素a/b结合蛋白基因(Gb Lhcb4)的结构及其相关的转录调控元件,基于Roche454高通量测序获得的Gb Lhcb4基因片段,采用RACE技术分离得到该基因的c DNA序列,并通过染色体步移技术获得该基因启动子序列,结合生物信息学技术分析基因序列的特征、系统进化地位及启动子区域的转录调控元件。序列分析表明,Gb Lhcb4基因全长1 200 bp,含有一个834 bp开放阅读框,编码277个氨基酸,相对分子量为30.65 k D,等电点为5.17。同源分析表明,该基因编码蛋白与北美云杉Ps Lhcb4蛋白(Gen Bank登录号:ABK21281.1)相似性最高,为74.7%。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件,同时还存在激素响应、组织特异性表达、细胞周期等相关调控元件。此研究分离得到银杏Gb Lhcb4基因及启动子序列,并进行了相关的生物信息学分析,为探究银杏Gb Lhcb4基因应答环境信号的转录调控机制提供了分子基础。     

油桐LEAFY同源基因片段的克隆与分析

根据不同植物LEAFY（LFY）同源基因序列的保守区,设计合成1对简并引物,利用该引物通过PCR技术从油桐基因组DNA中分离出1条长约1050bp的LFY同源基因（TUNGlfy）片段,克隆到pMD18-T载体,以期为进一步研究LFY基因表达特性及其与油桐成花生物学的关系打下基础.进行测序和生物信息学分析的结果表明,该片段长1059bp,在中间有1个长639bp的内含子,前面的外显子长294bp,后面的长126bp,共编码135个氨基酸,拼接位点与其它植物的LFY同源基因一致;其推导蛋白质序列与其它植物LFY同源基因的相似性为88%～97%,其中与毛白杨的相似性最高,达到了97%,推测它们具有相似的功能.     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

美国白蛾内参基因的鉴定及筛选

【目的】为筛选美国白蛾在不同温度处理、不同发育阶段、幼虫不同组织中稳定的内参基因,为美国白蛾相关的基因定量研究奠定基础。【方法】在美国白蛾转录组测序结果中筛选出8个候选内参基因GAPDH、ACT、RPL12、RPL18a、RPS16、EF1α、EF1β、18S rRNA,获得碱基序列。将以上序列进行克隆、测序、比对最终证明其为美国白蛾的基因且碱基序列正确,之后将其上传到NCBI获得登录号。设计以上8个候选内参基因的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物,利用qRT-PCR技术测定8个候选内参基因在美国白蛾不同发育阶段(幼虫1～6龄)、不同温度处理下(-10、-5、0、25、35、40、45℃处理2 h)、幼虫的不同组织(头、肠道、脂肪体、马氏管、表皮)中的表达量,记录C_t值;然后通过ΔC_t法、GeNorm、NormFinder和BestKeeper共4种方法对8个候选内参基因在不同条件下的C_t值进行统计分析,最后综合RelFinder选出最稳定的内参基因。通过GeNorm计算V_(n/(n+1))最合适内参基因的数目。【结果】C_t分析表明,在不同发育阶段和在不同温度处理下表达最稳定的是RPL12;在幼虫不同组织中,最稳定的是RPS16。GeNorm分析结果与ΔC_t分析结果相同。NormFinder分析表明,在不同的发育阶段和不同温度处理下最稳定的候选内参基因分别是RPL18a和EF1α;在幼虫组织中,最稳定的是ACT。BestKeeper分析认为,不同发育阶段,ACT、GAPDH不适合作为内参基因;不同温度处理下,ACT、RPL18a、RPL12、RPS16、EF1β不适合作为内参基因;在不同幼虫组织中,RPL18a、EF1α、EF1β、18S rRNA不适合作为内参基因。最后RelFinder综合评价显示,在不同的发育阶段最稳定的内参基因组合是RPL12和EF1β,最不稳定的是ACT;在不同的温度处理下,最稳定的内参基因组合是EF1α和GAPDH,最不稳定的是ACT;在不同组织中,最稳定的组合是ACT和RPS16,最不稳定的是RPL18a。经GeNorm软件计算,最合适的内参基因数目应该是2个。【结论】在美国白蛾不同发育阶段的基因定量研究中,建议以RPL12和EF1β作为内参基因;在不同温度处理的基因定量研究中,建议以EF1α和GAPDH作为内参基因;在幼虫不同组织的基因定量研究中,建议以ACT和RPS16作为内参基因。此外,亦初步说明了昆虫内参基因在不同试验条件下的不稳定性。     

版纳龙竹CONSTANS同源基因的克隆与序列分析

以版纳龙竹基因组DNA为模板,采用前人基于水稻CO同源基因Hd1序列的保守区所设计的特异引物COS1和COA1,运用PCR方法扩增出一条1 520 bp的DNA片段,并克隆到pGEM-T载体。测序和序列分析结果显示:该片段含有1个590 bp的内含子,编码区930 bp共编码310个氨基酸;该基因被命名为DxCO1,其DNA序列在G enB ank中的注册号为GQ358925。在G enB ank中进行同源性检索的结果显示:其核苷酸序列与其它禾本科植物CO同源基因的氨基酸序列同源性高达81%~91%;推测的DxCO1蛋白质序列与其它种子植物CO同源基因蛋白质序列的系统发育分析结果显示:DxCO1与小麦Hd1-like等5个基因聚成了一个强烈支持的分支;另外,在该片段推测的蛋白质序列的氨基端含有一个类似锌指蛋白的B-box(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)结构域,羧基端含有一个CCT(CO,CO-like,TOC1)结构域。序列和结构的高度同源性表明:DxCO1是版纳龙竹的1个CO-like基因,可能对其开花调控有着重要作用。     

诺丽Actin基因片段克隆及实时荧光定量PCR方法的建立

为了解决诺丽实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测中无内参基因的现状,根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以诺丽果实总RNA反转录成c DNA为模板,进行PCR扩增,扩增出的基因片段克隆到p MD-18T载体,阳性克隆经PCR鉴定后测序。序列结果表明:该片段长393 bp,编码131个氨基酸;所得序列与麦蓝菜actin 1有最高的一致性(96%)和相似性(98%)。q RT-PCR结果表明,诺丽Actin基因在诺丽的各个组织、果实不同发育时期都能稳定表达,且表达水平基本一致,适合在诺丽基因表达研究中作为内参基因。     

光皮桦实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】利用定量PCR和表达分析软件研究候选内参基因在光皮桦不同组织中的表达稳定性,并通过目的基因的表达分析验证其可靠性,以获得可用于光皮桦定量PCR的稳定内参基因。【方法】选取16个常用的看家基因作为候选内参基因,设计引物,通过普通PCR、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性;通过实时荧光定量PCR及软件ge Norm、Norm Finder和Best Keeper分析候选内参基因在光皮桦16个不同组织中的表达稳定性,根据分析结果筛选出最佳的内参基因和组合,并进一步通过2个目的基因CSLD和KOR对内参基因的稳定性进行验证。【结果】PCR和电泳结果显示,候选内参基因PCR目的片段条带清晰单一,熔解曲线也呈现明显的单一峰,表明这些引物的特异性良好。利用特异引物,对这些候选基因在16个不同组织的表达进行分析,发现除了18S,其他基因的Ct值均集中在25~30之间,表明内参基因在不同组织中表达较稳定,它们之间的表达水平差异不明显。Norm Finder和Best Keeper分析结果均表明基因EF1α的稳定性最好,ge Norm计算得出最稳定的是TATA,而UBi-lp在所有候选内参基因中表达最不稳定。进一步选取3个稳定表达候选基因(EF1α,TATA和UBi4)及稳定性较差的UBi-lp作为内参基因,对2个目的基因CSLD和KOR在不同组织中的相对表达进行分析,结果表明这2个目的基因相对于3个稳定的内参基因显示出一致的相对表达量,而不稳定的内参基因UBi-lp并没有对表达数据进行有效的标准化,结果存在明显偏差。【结论】通过实时荧光定量PCR及综合3种软件分析的结果,在光皮桦不同的组织中,EF1α,TATA和UBi4内参基因的表达稳定性高,对这3个基因进行验证并明确其作为荧光实时定量PCR内参的可靠性。因此,EF1α,TATA和UBi4可作为研究基因在光皮桦不同组织器官中表达的稳定内参。     

杉木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]筛选适用于杉木不同组织荧光定量PCR分析的稳定内参基因,提高杉木实时荧光定量PCR试验准确性,为杉木体内各个基因表达分析提供合适内参基因。[方法]通过实时荧光定量PCR获取GAPDH、EF1α、18S rRNA、28S rRNA、UBQ、UBC与Actin 7个候选内参基因在杉木无性系的根、茎和叶中的溶解曲线与Ct值;利用软件geNorm、Normfinder和BestKeeper对候选内参基因的表达稳定性进行评价;通过分析2个纤维素合酶基因ClCesA1和ClCesA2在杉木不同组织部位的相对表达情况,对候选内参基因的稳定性进行验证。[结果]geNorm、Normfinder和BestKeeper分析结果均表明:在杉木根和茎中最稳定的内参基因是EF1α和Actin; geNorm、Normfinder结果显示杉木叶中稳定的内参基因是UBQ和EF1α, BestKeeper显示杉木叶中最稳定合适内参基因是EF1α和Actin。以Actin与EF1α作为内参基因,荧光定量PCR分析表明,ClCesA1和ClCesA2基因的相对表达量在杉木不同组织中均有所不同,ClCesA2的相对表达量在各个组织中均高于ClCesA1。以不同内参基因作为试验内参基因分析ClCesA1和ClCesA2的表达情况得到,ClCesA1和ClCesA2在各个组织中的相对表达量排序主要为茎叶根。[结论]7个候选内参基因中,杉木不同组织中稳定表达的为Actin与EF1α,适合作为表达分析的内参基因;28S rRNA的表达稳定性低,不适合作为杉木定量PCR分析的理想内参基因。     

苹果属无融合生殖SERK1基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为探讨苹果属植物无融合生殖分子机制。[方法]以苹果属平邑甜茶及杂种后代33#为试材,以苹果基因组CDS序列设计引物,通过PCR扩增技术克隆出SERK同源基因的cDNA全长序列,命名为MhSERK1和MhdSERK1(GenBank登录号JQ231273和JQ231272),利用实时定量RTqPCR的方法检测了这两个基因在平邑甜茶和杂种后代各组织和器官中的表达模式。[结果]序列分析显示MhSERK1和MhdSERK1编码区序列全长为1 899 bp和1 881 bp,分别编码632和626个氨基酸,其氨基酸序列与其他植物的SERK1同源基因所编码的氨基酸同源性都在80%以上,特别是与葡萄科龙眼品种同源性最高,高达92.56%,与模式植物拟南芥、烟草等植物的SERK同源基因都具有很高的同源性。实时定量PCR结果表明,在平邑甜茶和杂种后代不同组织、花器官中SERK1基因的表达量存在差异,其中在子房中的表达量最高,在营养生长的组织中表达量很低,在平邑甜茶花蕾期的子房中表达量最高。[结论]推测该基因在平邑甜茶和杂种后代的生殖发育过程中可能发挥重要作用。     

竹子捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长的克隆和序列分析

采用RT-PCR技术与RACE技术,从绿竹中克隆到捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA,命名为cab-BO1(GenBank登记号:EF061137).该基因长1 102 bp,从第64～861 bp含有1个开放阅读框,编码265个氨基酸.cab-BO1编码的氨基酸中第64～232位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,第9～11位为蛋白激酶C的磷酸化位点,第27～52位为泛素结构功能域信号,第55～58位为酪氨酸激酶(CK2)磷酸化位点.序列相似性分析结果表明:cab-BO1 DNA序列和编码的氨基酸序列与玉米、小果野蕉、小麦、水稻等的cab基因及其氨基酸序列的相似性分别在85%和89%以上,显示了cab家族基因在进化过程中的保守性.     

落叶松LaIAA2基因的克隆及表达分析

以落叶松扦插生根率存在显著差异的2个优良全同胞无性系茎和根为材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建正、反2个落叶松扦插生根过程差别表达cDNA文库。序列分析获得1个AUX/IAA基因片段。运用Race技术,成功获得这个Aux/IAA基因的全长。同时,运用实时定量PCR和半定量PCR技术分析这个基因的表达谱,结果表明:LaIAA2基因在茎中高表达,叶中低表达。在生长素处理后,LaIAA2基因表达明显增加,表明这个基因受生长素调控。     

中间锦鸡儿fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究

以我国重要的生物能源灌木--中间锦鸡儿枝叶和种子为材料,根据GenBank中已经发表fad2基因的同源序列,利用PCR技术克隆得到基因片段.在GenBank中Blast(GenBank登录号AY957393)所得基因片段和同属豆科的Glycine max Gmfad2-2a同源性高达88%,位于fad2基因编码区中部.将所得片段经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建了反义表达载体pBI121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和氨苄青霉素的再生烟草植株.初步分析结果表明:与对照烟草相比,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异,而亚油酸则减少10.3%.     

杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析

利用CODEHOP设汁CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112～651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱.疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋(40.62%)与不规则盘绕(45.31%)为主,没有发现β转角区域.     

旱柳在Pb、Cd胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于Pb与Cd胁迫下旱柳实时荧光定量PCR的内参基因,应用荧光定量PCR技术分析UBQ1、TUB6、Actin、EF1α、18SRNA、GAPDH、TUA8和UBQ2这8个内参基因在旱柳根部的表达情况。通过Normfinder、ge Norm和Best Keeper3个软件进行综合分析,发现在Pb与Cd胁迫下表达较为稳定的内参基因均为EF1α、GAPDH和Actin,差别是在Pb胁迫下的旱柳根组织中最为稳定的内参基因是EF1α,而在Cd胁迫下的旱柳根组织应最稳定的内参基因为GAPDH。该研究结果可用于旱柳根组织在Pb、Cd胁迫下基因表达的进一步研究。     

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株基因组序列由Sanger测序的方法得到。拼接后获得了121 268 bp序列,GC含量为36.76%。以长度不小于50 aa的序列认定为功能基因,共预测到131个开放阅读框,通过Blast比对,其中87个能注释到功能基因。对基因组序列进重复序列分析,共发现SSR位点174个,同源重复序列1个。在SSR位点中,包含6种长度的重复基序,且以富含AT的重复基序为主。同源重复序列两端为一59 bp片段或其一部分组成的重复序列,两端分别重复12次和7次,中间则为一段与重复片段无关的236 bp片段。与武汉株相比,广西株病毒在37个核心基因中有4个存在蛋白序列长度上的差异,而在其他非核心基因中有6个基因仅存在于一个病毒株中,另有13个基因存在蛋白序列长度上的差异。     

慈竹WRKY转录因子基因克隆及其胁迫诱导表达

为了解慈竹WRKY生物学功能以及通过基因工程手段改良竹类植物。利用已获得慈竹转录组数据,克隆获得2条WRKY转录因子,分别命名为BeWRKY1(Gen Bank:KJ462124)和Be WRKY2(Gen Bank:KJ462125),两者分别编码189和295个氨基酸残基。序列分析表明,两者编码的蛋白均含有一个完整的WRKY superfamily的保守结构域。BeWRKY1属于Ⅱc亚家族;Be WRKY2则与Ta WRKY16和AtWRKY39等聚为一枝,属于Ⅱd亚家族。定量PCR分析表明,Be WRKY1和Be WRKY2分别在茎和完全展开叶中具有较高表达量。200mmol·L~(–1)NaCl和20%PEG 6000胁迫处理激活了Be WRKY1表达,却减少了BeWRKY2的转录积累。结果表明BeWRKY1可能短时间内迅速参与逆境响应;Be WRKY2对干旱和ABA胁迫伤害更为敏感,而可能不参与高盐类胁迫保护反应。     

超表达牛奶子EutPDS提高番茄果实番茄红素含量

【目的】牛奶子果实中富含番茄红素,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是番茄红素生物合成上游的重要酶。特异性超表达牛奶子Eut PDS基因(Gen Bank登录号:GQ254067),以期提高番茄果实中的番茄红素含量。【方法】通过RT-PCR方法从牛奶子果实中分离EutPDS基因cDNA及基因组全长,Southern杂交分析基因的拷贝数,专用软件分析此基因及蛋白结构。采用番茄2A11启动子构建果实特异性超表达载体,转化根瘤农杆菌GV3101后,借助农杆菌介导的叶盘法转化至‘中蔬四号’番茄。半定量RT-PCR检测转基因植株果实EutPDS基因的表达,高效液相色谱仪、实时定量PCR分别用于分析转基因番茄果实主要类胡萝卜素组分含量和内源类胡萝卜素代谢相关基因表达的变化。【结果】从牛奶子中克隆的EutPDS基因长度为1 920 bp,含有1 749 bp ORF。其基因组序列无内含子,单拷贝。EutPDS编码1个582个氨基酸的蛋白,该蛋白与其他植物PDS有很高的同源性,具有典型的二核苷酸结合域、类胡萝卜素结合域。采用农杆菌介导方法转化番茄叶盘,PCR检测,潮霉素筛选,成功获得了2个EutPDS转基因番茄株系,其果实颜色较对照更红。半定量分析显示外源EutPDS基因在转基因番茄果实中超表达,实时定量PCR分析表明番茄红素生物合成上游2个内源基因Sl PSY和Sl ZDS受影响显著上调,同时1个下游基因Sl LCY-e的表达则显著下调,使得转基因番茄果实中番茄红素含量为野生型的2倍,但β-胡萝卜素含量无显著变化。【结论】在番茄果实中特异性超表达牛奶子EutPDS基因可有效促进番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

猕猴桃溃疡病菌抗铜基因CopB克隆及序列分析

【目的】猕猴桃溃疡病菌通过抗铜相关基因的表达和调控而表现出一定的抗铜性,研究抗铜基因对揭示病原菌的抗铜机理、病害的灾变机理以及有效防控具有重要意义。本研究旨在明确湖南地区猕猴桃溃疡病菌抗铜基因CopB的序列结构,为进一步研究该病菌的抗铜机理及制订相关防治策略提供参考依据。【方法】利用引物copB-F/copB-R对湖南猕猴桃溃疡病菌抗铜基因CopB进行PCR扩增并进行核苷酸序列分析及编码蛋白质预测。采用BLAST进行序列比对,ProtParam分析蛋白理化性质,ProtScale预测蛋白亲疏水性,DNAMAN进行氨基酸多序列比对,MEGA5进行系统进化树分析。【结果】获得猕猴桃溃疡病菌Psa-FHHY株系、Psa-JSHY株系、Psa-JSJK株系的CopB基因片段为891 bp,编码296个氨基酸,编码的氨基酸不稳定性系数为32.29,该基因编码蛋白质的相对分子质量为31.853 kD,理论等电点为4.66,总平均疏水指数（GRAVY）值为-0.342,为亲水性蛋白。BLAST分析结果表明,所扩增的猕猴桃溃疡病菌与其它猕猴桃溃疡病菌株CopB基因相似性在98.32%以上,与其它丁香假单胞菌属的CopB基因相似性在60.57%～95.06%。【结论】湖南猕猴桃溃疡病菌抗铜基因CopB保守性强,具有较高的系统进化一致性,未出现明显变异。     

黄藤2个NAC基因的分子特征及其SSR分子标记开发

【目的】棕榈藤是重要的森林植物,纤鞭是其重要的攀援器官,也是重要的分类依据。研究黄藤NAC(NAM,ATAF和CUC)转录因子基因的分子特征并开发SSR分子标记,以期为棕榈藤的分子育种和辅助分类提供参考依据。【方法】以黄藤为材料,借助转录组数据,采用同源克隆的方法从黄藤中分离NAC基因,采用生物信息学方法进行基因结构、蛋白性质与结构分析和SSR位点预测,采用实时定量PCR技术分析基因的组织表达特性,利用PAGE电泳和测序技术分析SSR分子标记在不同棕榈藤样品中的通用性和多态性。【结果】从黄藤叶片中获得了2个NAC同源基因DjNAC3(Gen Bank登录号:KU556738)和DjNAC4(Gen Bank登录号:KX579750),二者的开放阅读框长度分别为729 bp和1 326 bp,对应的基因组序列为850 bp和1 441 bp,均包含2个外显子和1个内含子。DjNAC3和DjNAC4编码的蛋白分别为242 aa和441 aa。蛋白结构分析表明,DjNAC3和DjNAC4具有典型的NAC转录因子结构特征,属于NAC家族的CUC亚家族,但二者之间的相似系数仅为23.6%,表明它们在黄藤生长发育过程中可能具有不同的功能。DjNAC3和DjNAC4在不同组织中的表达模式存在明显差异,DjNAC3在发育成熟纤鞭中的表达丰度最高,叶片中的表达丰度最低,而DjNAC4则在发育成熟的钩刺中表达丰度最高,而发育初期的钩刺中最低。在DjNAC3和DjNAC4的基因组序列中分别包含1个SSR位点,其中前者的SSR位点位于内含子区域,为(TA)6,后者的SSR位点位于第1个外显子区域,为(GCA)5。根据DjNAC3和DjNAC4中SSR位点旁侧序列设计引物,以黄藤和另外20个不同棕榈藤样品的基因组DNA为模板进行扩增,PAGE电泳结果分析表明,引物具有较高的通用性,且扩增产物具有多态性。6个样品的测序结果证实,用DjNAC3设计引物的扩增产物测序获得的SSR位点序列存在着一定的差异,既包括SSR类型变异、重复次数变化等多态性,又有SSR位点缺失的现象;而根据DjNAC4设计引物扩增获得的SSR位点序列差异主要为重复次数的变化。【结论】黄藤DjNAC3和DjNAC4基因的基因结构、表达模式、SSR位点等均存在明显的差异,这表明它们在黄藤生长发育中可能具有不同的功能,二者所包含的SSR分子标记具有通用性和多态性,可以作为分子标记应用于棕榈藤的辅助分类和分子辅助育种。     

榅桲C4H基因的克隆、序列分析及表达

【目的】肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)是调节木质素合成的关键基因,榅桲是新疆特色经济果树之一。目前,有关榅桲C4H基因的序列信息尚不明确。为了获得该基因的序列信息及其在果实不同发育时期的差异性表达规律,为深入研究该基因在榅桲果实发育过程中的作用和功能奠定基础。【方法】以榅桲果实为研究材料,基于GenBank已登录近源物种的C4H基因的cDNA序列,提取其果实的总RNA并反转录为cDNA,利用同源克隆的方法获得榅桲C4H基因的cDNA序列,并对该序列进行生物信息学分析,同时检测在榅桲果实开花后不同时间点C4H基因表达量的差异。【结果】同源克隆结果表明:C4H基因编码区的序列全长为1 518 bp,编码505个氨基酸,其蛋白的分子质量为58.28 kD。生物信息学分析结果显示:榅桲C4H蛋白为亲水性不稳定蛋白质,其二级结构以α-螺旋和无规卷曲结构为主。系统进化分析结果显示:榅桲C4H蛋白与甜樱桃(Prunus avium,XP_021806844.1)、山杏(Prunus armeniaca,VVA16404.1)的C4H蛋白同源性均较高,其相似性分别为92.87%和91.24%。实时荧光定量PCR的结果显示:随着榅桲果实的发育,在开花后10 d的果肉中C4H基因的表达量最高,随着果实的不断发育,果肉中C4H基因的表达量逐渐减少。【结论】成功获得了榅桲C4H基因全长编码区序列,并发现了C4H基因在果实发育初期的表达最高,这与榅桲果实的木质化程度密切相关。