引进加拿大马铃薯种薯中病毒的检测

应用酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）对2000年种植于网室和田间隔离种植地的引进加拿大马铃薯种薯3个品种进行马铃薯黄矮病毒、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯Y病毒N株系（PVY^n）、马铃薯黑环斑病毒、烟草脆裂病毒、马铃薯X病毒和马铃薯S病毒（PVS）的检测。对网室样品中经ELISA检测怀疑为阳性样品再用组织超薄切片、直沾法和免疫电镜法制备电镜检样品做电镜观察。结果在网室的Russet Burbank品种上检出PVA和PVS，其它两品种检出PVS；田间隔离种植中检出PVY^n和PVS。     

应用A-蛋白诱捕修饰和羊抗兔血清诱捕双修饰法研究马铃薯X病毒

A-蛋白和羊抗兔血清应用于免疫电镜,检测马铃薯X病毒(PVX)粗汁液,灵敏度比诱捕修饰法高;而且加羊抗兔血清后,病毒粒体比诱捕修饰法明显加粗,在电镜放大2500倍时,就能清晰地观察到。用诱捕双修饰法检测PVX,证实在寄主植物的叶、茎和根中均存在,以叶内含量最高。接种在普通烟上第三天,接种叶就能检测到PVX,接种15天后,寄主体内病毒能达到较高浓度,而且高浓度一直可保持2个月以上;PVX在不同寄主中的含量不同,以普通烟中病毒浓度最高,心叶烟、番茄和黄花烟中次之;昆诺阿藜、千日红和大椒中含毒量极抵。用诱捕双修饰法检测马铃薯薯块休眠芽中的病毒获得成功。     

二重RT-PCR快速检测马铃薯病毒的方法

本研究采用传统的蛋白酶K法和病毒RNA简易浸提法,从马铃薯块茎、茎干、叶梗、叶片中提取马铃薯X病毒,马铃薯Y病毒,马铃薯A病毒及马铃薯卷叶病毒RNA,并设计了4种马铃薯病毒引物,优化了二重RT-PCR反应条件,可以同步扩增出上述4种病毒,扩增产生的靶带分别为562bp(PVX)、480bp(PVY)、336bp(PLRV)、255bp(PVA).应用病毒RNA简易制样技术和优化的二重RT-PCR反应条件,可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此研究还可适合于检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用.     

RT-PCR技术对宁夏马铃薯脱毒种薯病毒检测的研究

病毒病是影响马铃薯生产的重要病害,为了解宁夏地区马铃薯种薯生产中的病毒发生情况,在银川市、固原市和西吉县不同种植模式的脱毒种薯生产基地,对不同品种的原原种、原种、一级种在不同生育期随机采集样品,利用RT-PCR检测技术对4种马铃薯主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV和类病毒PSTVd进行检测。结果表明:PVX、PVY、PVS、PLRV在3个基地均有不同程度检出,成熟期病毒检出率分别为35%、28%、35%和34%,未检出PSTVd;4种病毒检出率在马铃薯现蕾期以后呈现显著性增长;病毒检出率随着种薯繁育级别增加差异显著;6个马铃薯品种均为感病品种;大田种植种薯的病毒检出率显著高于防虫网室。     

湖北省甘薯病毒病调查研究

甘薯病毒病在湖北省甘薯产区普遍发生,主要病状类型有:皱缩花叶型、卷叶型、叶片斑点型,其中表现皱缩花叶病的品种较多,占被调查品种的42%.用巴西牵牛作钻木,与显症甘薯植株进行靠接,80%的巴西牵牛新生叶片出现系统感染症状,其中皱缩花叶病传毒率88%.电镜观察有症状的巴西牵牛新生叶片,均有长线状病毒存在.另外,用电镜观察有明显症状的甘薯样品82个,在三种病症类型的病叶中均观察到了长线状病毒粒子.甘薯99和北京553两个品种中,病苗氨基酸含量均比正常薯块苗增加,增幅为17.9%～ 97.2%.鄂薯一号、51-93、南薯88的茎尖脱毒苗薯块比正常苗薯块增产9.0%～20.5%,比病苗薯块增产54.1%～128.9%.     

植物诱抗剂AHO联合茎尖培养脱除马铃薯S病毒和马铃薯Y病毒

研究了植物诱抗剂3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole, AHO)联合茎尖培养从试管苗中脱除马铃薯S病毒(PVS)?马铃薯Y病毒(PVY)的方法和效率?取PVS侵染的‘定薯3号’和‘定薯4号’以及PVY侵染的‘靖薯3号’和‘靖薯4号’的壮芽, 茎尖剥离后培养至4~5个叶片, 用100 mg/L植物诱抗剂 AHO水剂喷施试管苗, 每隔2 d喷施一次, 共3次, 末次喷施2 d后取茎尖剥离培养, 获得再生试管苗?用电子显微镜负染色?ELISA?荧光定量RT-PCR检测再生试管苗的带病毒情况?结果显示, AHO对4个品种的马铃薯试管苗生长无影响, 用AHO处理后再茎尖剥离培养, 脱毒率均高于未处理的对照; 检测结果还显示AHO处理的马铃薯再生苗的带毒量也低于未处理的对照, 且随处理次数增加带毒量下降?研究结果表明, 利用植物诱抗剂AHO联合茎尖剥离培养方法可以提高脱除PVS?PVY的效率, 获得无病毒核心苗?     

马铃薯Y病毒在种薯中检出率及其株系鉴定

 马铃薯是我国重要粮食和经济作物。马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害马铃薯生产的重要病害。种植脱毒种薯是防治PVY最有效的途径。马铃薯种薯携带PVY问题严重,但种薯中PVY株系还不清楚。本研究利用PVY特异性抗体检测了7个马铃薯品种362个种薯,发现不同品种种薯带毒率差异较大,最高达12%。通过RT-PCR方法扩增获得了7个PVY分离物编码区全序列。重组分析发现7个分离物基因组均为重组型,根据重组位点的差异可以分为PVY^NTN-NW(SYR-II型)、Rec-1、Rec-2和Rec-3等4种重组类型,后3种为新重组类型。系统进化分析发现,分离物HQH18G3-10与PVY^NTN-NW(SYR-II型)处于同一个大的分支,但与中国PVY大田分离物聚集在一起形成一个相对独立的组,命名为PVY^NTN-NW(CN型);其余6个分离物与数据库中的中国分离物聚集在PVY^N-Wi组。这暗示PVY中国分离物具有相对独立的进化过程,PVY马铃薯大田分离物和种薯分离物进化上相近。所有分离物均能在珊西烟上引起典型叶脉坏死症状,HQH18G3-10引起的坏死症状最为严重。本研究首次报道了我国种薯内PVY发生情况,对分析病毒发生发展规律和防控具有借鉴作用。     

4个马铃薯品种感染马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的症状

马铃薯纺锤块茎类病毒在中国及世界许多国家都是检疫性病害, 该病害可大幅度降低马铃薯产量和品质。根据植株及块茎的症状, 汰除感病的马铃薯种薯, 是控制PSTVd传播和危害的重要手段。本研究利用分子克隆及测序技术, 分离并鉴定了PSTVd的分离物351-17, 利用PSTVd田间接种技术, 分别接种了4个黑龙江省常用的马铃薯品种‘夏坡地’、‘克新18’、‘荷兰15’和‘尤金’, 对其侵染后第一代的株高、叶片、块茎外观和单株产量进行了调查, 结果表明：4个供试马铃薯品种感染PSTVd后均表现出了一定的症状, 其中‘克新18’在株高、叶片和块茎的症状方面最为明显, 单株产量下降显著, 表明其对PSTVd非常敏感。     

北京地区一种侵染菊花的线条病毒

 从北京地区菊花病毒病株上分离到一种线条状病毒CA分离物。经寄主范围,传播方式、汁液体外抗性,外壳旧白分子量、粒体大小和在细胞中产生的内含体研究结果分析,此病毒为Potyvirus成员,沉淀反应,免疫双扩散反应和免疫电镜技术检测证明CA分离物与PVY在清学相关性。CA分离物已制备抗血清和提纯IgG,并应用于品种菊组培苗脱毒检测工作。     

非洲菊三种病毒的快速检测及其组培脱毒方法

利用感染了番茄黑环病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的非洲菊叶片,建立同步检测非洲菊3种病毒的多重RT-PCR和实时荧光RT-PCR,多重RT-PCR可一次性扩增出3种病毒的DNA条带,最低可检测到相当于1μg的带毒叶片;实时荧光RT-PCR可分别检测相当于1 ng、1 ng和100 Pg的带毒叶片.同时采用茎尖、叶片和花托组织培养脱毒并结合培养基添加病毒A的脱毒方法,对接种3种病毒的非洲菊进行外植体脱毒试验,获得非洲菊组培苗脱毒方法.用建立的多重RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测脱毒效果,茎尖脱毒率分别为75.0%和66.7%,花托脱毒率分别为52.0%和54.5%.     

马铃薯早死病种薯带菌研究

马铃薯早死病的病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)在种薯块茎中主要存在于薯脐、芽眼及表皮中,新鲜薯块的维管束环及髓心组织中末发现病原菌。从病株及健株得到的薯块上都带有病原菌。带菌与植株是否发病无关。     

甘薯脱毒技术及增产效果研究

作者于１９８８～１９９５年研究了甘薯病毒及甘薯脱毒技术,明确了侵染山东甘薯的主要病毒种类是甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒,在国内首次分离侵染甘薯的烟草花叶病毒,探明了其生物学特性。筛选出适合山东甘薯茎尖培养基的最佳激素配比,浓度,ｐＨ值。探索了脱毒薯的增产机理和增产效果,提出了组织培养,茎尖苗检测,脱毒薯速率与推广应用的配套技术规程,培养出徐薯１８等１２个品种的脱毒苗,平均增产４２．９％出干率提高     

酶联免疫吸附法(ELISA)检测花生种子带毒的研究

 利用花生上分离到的花生轻斑驳病毒(PMMV),黄瓜花叶病毒CA株系(CMV-CA),花生矮化病毒Mi株系(PSV-Mi)所制备的抗血清,从中提取IgG、应用ELISA间接法检测花生种子,在花生种子中不程度地都检测出带有PMMV、CMV、PSV病毒,而且有复合带毒现象。经催芽的花生种子子叶、胚芽及胚根分别用PMMV和CMV免疫制备的抗体进行检测,花生的上述三部分均带有PMMV和CMV病毒,且胚芽中病毒量最高。萌发种子及未萌发种子的子叶无论从带毒率还是病毒含量上均看不出明显的差异。ELISA间接法由于直接利用商品酶标抗体,简化了试验程序,利于对种子带毒进行快速检测。     

马铃薯青枯病无公害防治方法

马铃薯青枯病在马铃薯幼苗和成株期均能发生。植株染病典型症状是病株稍矮缩,下部叶片先萎蔫后全株下垂,开始早晚恢复,持续4-5d后全株茎叶全部萎蔫死亡,但仍保持青绿色,也有时1个主茎或1个分枝萎蔫,其它茎叶生长正常,植株基部横部可见维管束变褐。薯块染病后,芽眼呈灰褐包水浸状,并有脓液,切开薯块,切面可自动溢出乳白色菌脓。     

马铃薯Y病毒在种薯中检出率及其株系鉴定

马铃薯是我国重要粮食和经济作物。马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害马铃薯生产的重要病害。种植脱毒种薯是防治PVY最有效的途径。马铃薯种薯携带PVY问题严重,但种薯中PVY株系还不清楚。本研究利用PVY特异性抗体检测了7个马铃薯品种362个种薯,发现不同品种种薯带毒率差异较大,最高达12%。通过RT-PCR方法扩增获得了7个PVY分离物编码区全序列。重组分析发现7个分离物基因组均为重组型,根据重组位点的差异可以分为PVY^NTN-NW(SYR-II型)、Rec-1、Rec-2和Rec-3等4种重组类型,后3种为新重组类型。系统进化分析发现,分离物HQH18G3-10与PVY^NTN-NW(SYR-II型)处于同一个大的分支,但与中国PVY大田分离物聚集在一起形成一个相对独立的组,命名为PVY^NTN-NW(CN型);其余6个分离物与数据库中的中国分离物聚集在PVY^N-Wi组。这暗示PVY中国分离物具有相对独立的进化过程,PVY马铃薯大田分离物和种薯分离物进化上相近。所有分离物均能在珊...     

菊花母株病毒鉴定及其茎尖组培脱毒苗的病毒检测

选用显斑驳症状的兼云香、赤线金钩和叶片黄化的泉乡万圣和泉乡冲天等共4个品种的葡萄母株，龙茎脱毒获得的茎组培苗用生物学和血清学方法检测葡萄母株和组培苗的带毒情况。鉴定结果表明，兼云香母株（1A）带有葡萄B病毒，其组培苗未能脱去该病毒。赤线金钩母株（2A）带有番茄不孕病毒（TAV）和葡萄B病毒（CVB）复合侵染，其组培苗脱去了TAV病毒还带有CVB病毒。万乡泉圣母株（3A）和泉乡冲天母株（4A）带有菊花B病毒，其组培苗均脱去了此病毒，是真正的脱毒组培苗。     

鲜食马铃薯中青枯病菌的检测

在口岸送检的鲜食马铃薯上分离到一株细菌分离物0297,对该分离物在薯块上的为害症状和菌落形态特征进行观察,并经特异引物PCR检测、多位点序列分析、致病性测定.结果表明:患病薯块切面维管束变褐,按压分泌乳白色菌脓,分离物菌落在NA培养基上呈有光泽的乳白色;青枯病菌特异引物RS32/RS37扩增分离物0297得到预期583...     

马铃薯Y病毒CP基因的原核表达及免疫金标试纸条的研制

选取马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）代表株（NC＿001616.1）外壳蛋白基因37～281区间，采用化学合成方法合成目标序列，将其连接到原核表达载体pET-32a（+），并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达出45 kDa融合蛋白，回收后免疫日本大耳白兔制备抗血清。Western Blot分析多克隆抗体特异性良好，后制备25 nm胶体金，标记PVY CP37-281多克隆抗体，制备胶体金免疫层析试纸条。结果表明，试纸条能在15 min内检出PVY,PVY病株汁液检测稀释限度可达106倍（W/V），使用常见复合侵染烟草检测，未出现交叉反应。由此可知，该试纸条操作简便，反应灵敏特异，适用于田间一线及种薯生产中马铃薯Y病毒的检测。     

利用RNA干扰介导抗病性获得兼抗四种病毒的转基因马铃薯

为获得兼抗马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)和马铃薯潜隐花叶病毒(Potato virus S,PVS)4种病毒的转基因马铃薯新材料,分别以这4种病毒全长CP基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得4种病毒CP基因相对保守区段的基因片段,并将其拼接成融合基因,以载体pHANNIBAL和pBI121为基础,构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,利用农杆菌介导的转基因体系进行马铃薯遗传转化,并对获得的转基因马铃薯进行病毒抗性检测。结果表明,所获得的融合基因片段RH1和RH2,酶切鉴定分别得到长度为1 200 bp的条带,与预期片段相符;构建了含pdk内含子和RH1、RH2融合基因的RNAi植物表达载体,经Bam H I/Sac I双酶切,获得长度约3 200 bp的片段,表明RNAi植物表达载体pBI121-pRH构建成功;转化易感病毒马铃薯品种陇薯11号,PCR检测和PCRSouthern杂交分析表明融合基因已整合到陇薯11号马铃薯基因组中;抗病性检测显示4株转基因马铃薯植株对4种病毒均免疫。表明利用RNAi可筛选出抗多种病毒的转基因马铃薯新种质。     

胶体金免疫电镜技术检测和鉴定病汁液中不同形态的植物病毒

 本文报道胶体金免疫电镜技术的建立:铜网捕获病毒后,用其稀释约200倍的同源抗血清修饰处理3~5分钟,羊抗兔IgG-金复合物标记3~5分钟,经磷钨酸负染,电镜下可见病毒粒子周围金颗粒特异性吸附,而背景上非特异性吸附很少。用此技术成功地快速检测和鉴定了病汁液中线状病毒(大麦黄花叶病毒,大麦温和花叶病毒,小麦梭条斑花叶病毒,芜菁花叶病连和马铃薯Y病毒)、棒状病毒(烟草花叶病毒、长叶车前草花叶病毒和土传小麦花叶病毒)以及球状病毒(水稻矮缩病毒、黄瓜花叶病毒和大麦黄矮病毒)。用0.5M PBSpH7.0制备病汁液,可大幅度提高同源抗血清对黄瓜花叶病毒的捕获能力。