胚胎的不同处理对兔类ES细胞分离培养的影响

探讨兔(Lepus brachyurus)胚胎的不同处理方法对兔早期胚胎体外发育能力的影响,筛选出适合兔类胚胎干细胞(embryonic stem,ES)分离培养的兔胚胎的较佳处理方法。将兔胚胎用3种不同的方式进行处理,观察兔类ES细胞贴壁、克隆、生长情况,并对所得的兔类ES细胞进行碱性磷酸酶活性鉴定、干细胞转录因子的RT-PCR检测和体外分化能力的鉴定。结果显示,挑破透明带法和胚胎分割法较对照组得到的胚胎更容易贴壁和增殖,差异显著(P0.05),虽然离散胚组的胚胎贴壁率(88.9%)显著高于挑破透明带组(53.8%)(P0.05),但挑破透明带组的ICM形成率(48.8%)高于离散胚组(40.0%)(P0.05),挑破透明带组F1、F2代兔类ES细胞的克隆率分别为35.7%和33.9%,均显著高于其他两组(P0.05),最高传至30代。获得的兔类ES细胞经碱性磷酸酶染色检测呈阳性。提取兔类ES细胞集落的RNA,经RT-PCR检测,得到扩增多能基因GAPDH、Nanog和Sox2与预期大小一致的目的片段。体外分化形成具有3个胚层构成的类胚体(embryoidbodies,EBs)。结果表明,挑破透明带有利于提高从兔胚胎中分离胚胎干细胞的效率,能更好的支持兔类ES细胞的培养与增殖。     

猪胚胎干细胞培养、分离和传代

摘要:利用五指山小型猪近交系不同发育阶段的早期胚胎为材料，探索猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)培养、分离、传代的影响因素，以选择猪胚胎干细胞建系的适宜条件。收集五指山猪第5～10 d胚胎(配种当天记为0 d)，以 STO细胞[STO细胞是来自SIM小鼠(S)胚胎对硫代鸟嘌呤(thioguanine,T)和乌本苷(ouabain,O)有抗性的成纤维细胞系]为饲养层，分别采用两种培养液: 杜氏培养液(Dulbecco's modified eagle medium ，DMEM) + 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+ 10 %新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）+1 000 IU/mL白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）+ 30 ng/mL干细胞生长因子（stem cell growth factor , SCF）+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)或DMEM + 10% NBS + 10% FBS + 1 000 IU/mL LIF + 30 ng/mL SCF。比较发现，培养液中是否加入bFGF对胚胎干细胞的培养无显著影响；实验共收集胚胎124枚，其中D5～6胚胎18枚，胚胎贴壁率为68.8% ，内细胞团出现率为6.3% ，未能传代；收集D7孵化囊胚27枚，贴壁率为100% ，内细胞团出现率为38.9% ，传代1次失败；D9胚胎18枚，贴壁率为100%，传代后ES细胞生长较缓慢；收集D10胚胎52枚，胚胎贴壁率为100%，传代率为100%，传代后可出现ES细胞克隆点；实验过程中比较了胚径对干细胞培养的影响，发现胚径越大，培养效果越好，胚径大于100μm,分离ICM后出现干细胞集落成功率达100%，并得到了AP染色呈阳性的传4代的ES细胞集落。     

不同添加物对分离昆明系小鼠胚胎干细胞的影响

以昆明系小鼠(Mus musculus Km)胚胎为材料,以丝裂霉素(10 μg/mL)处理的MEF为饲养层,研究了在胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)培养液中分别添加血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和FBS PD98059(50 μgol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、内细胞团(inner cell mass,ICM)集落形成及ESCs分离培养的影响.结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,胚胎贴壁率显著低于添加FBS(P<0.05),ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著(P>0.05),2～5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS(P<0.05),2株ESCs传到7代;在ESCs培养液中添加FBS PD98059,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1～5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS(P<0.05);用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1～5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/LEDTA(P<0.05).实验结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS PD98059更适合用于分离培养昆明系mESCs,用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA.     

一种简单的分离猪囊胚内细胞团的方法

本研究尝试了酶消化法分离猪囊胚内细胞团(ICM)的方法，并初步测定了分离到的ICM形成原代类胚胎干(embryonic stem，ES)细胞集落的能力。     

影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素

探讨胚龄培养液、细胞因子、饲养层细胞等因素对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响。以4～13周龄流产胎儿生殖嵴或性腺为材料，小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、人胎儿成纤维细胞(hEF)、STO细胞和牛胎儿成纤维细胞(bEF)作饲养层，高糖DMEM(Dulbecco's minimum Eagle’s medium)为基础培养液，添加10^-4mol／L 2Me(2-巯基乙醇)、胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBS)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞冈子(SCF)等为培养液，探讨影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素。结果表明7～12周流产儿适于人类胚胎生殖细胞的分离克隆；人类胚胎生殖细胞体外培养以添加15％FBS为宜：添加4ng／mL LIF 4ng／mL bFGF 20ng／mL SCF能明显改善人类胚胎生殖细胞的分离克隆；MEF、STO、bEF和hEF可提高人原始生殖细胞(PGCs)的贴壁率，能促进PGCs源的人类胚胎干细胞(ES)的分离效率；以MEF作为饲养层效果较好。     

L-Wnt3a细胞用于制备胚胎干细胞饲养层的研究

小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作为胚胎干细胞培养的饲养层细胞,受到细胞代次等因素限制,需要长期反复制备,消耗大量的实验动物。寻找可替代小鼠胚胎成纤维细胞支持干细胞生长增殖的稳定细胞系,对于降低干细胞的培养成本和减少工作量具有重要意义。L-Wnt3a细胞是一个能够稳定向细胞外分泌Wnt3A蛋白的永生细胞系,目前尚不清楚其是否支持小鼠胚胎干细胞的培养。本研究探讨L-Wnt3a作为饲养层细胞对于小鼠(Mus musculus)胚胎干细胞系的建立以及该细胞条件培养液对无饲养层培养小鼠胚胎干细胞的影响。实验结果表明,丝裂霉素C浓度为10μg/mL,作用4 h时,可显著抑制L-Wnt3a细胞的体外生长而不影响细胞的活力。用该细胞制备饲养层,原代分离、培养小鼠胚胎干细胞,成功建立小鼠胚胎干细胞系。利用L-Wnt3a细胞制备条件培养液进行胚胎干细胞的培养,结果显示,L-Wnt3a条件培养液可支持小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下自我增殖,该条件下培养的胚胎干细胞表达碱性磷酸酶、Oct4、Sox2、Nanog、E-cadherin(E-CAD)和SSEA-1多能性因子,并能够在体内、外分化为3个胚层,形成嵌合体后代。L-Wnt3a细胞作为饲养层细胞,能够成功分离获得小鼠胚胎干细胞,可以避免小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞存在的代数限制、制备繁琐等问题;并且LWnt3a条件培养液可以在无饲养层条件下维持小鼠胚胎干细胞的自我更新,能够在一定程度上有效避免饲养层细胞对胚胎干细胞造成的不利影响。     

不同添加物对分离昆明系小鼠胚胎干细胞的影响研究

本试验以昆明系小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素（10μg/mL）处理的MEF为饲养层,研究了在ESCs培养液中分别添加KSR、FBS、FBS+PD98059 (50 μmol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM集落形成及ESCs分离培养的影响。结果表明,在添加KSR的ESCs培养液中,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05）,但ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著（P>0.05）,2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05）,2株ESCs被传到7代;在添加PD98059+FBS的ESCs培养液中,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1~5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS的ESCs培养液（P＜0.05）;用0.5 g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1~5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA（P＜0.05）。结论：在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS+PD98059更适合用于分离培养昆明系小鼠ESCs,用0.5g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA。     

不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎

2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

国产丝裂霉素处理的STO细胞作为饲养层培养牛胚胎干细胞

寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义.本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠(Mus musculus)成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞)作为饲养层培养牛胚胎干细胞,为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据.用10、15、20、30和40 μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3.0和4.0 h的STO细胞;形态学观察不同代次STO细胞生长状态,并对生长在以STO细胞为饲养层的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色(AKP)、阶段特异性胚胎细胞表面抗原-4(OCT-4)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫组化检测、体外分化形成拟胚体等实验.结果显示,当丝裂霉素的浓度为15 μg/mL处理3.0 h可有效的抑制细胞分裂;STO细胞在5～10代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4和SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体.结果证明使用国产丝裂霉素能有效地处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能保持未分化状态,可以作为常规饲养层培养牛胚胎干细胞.     

CB处理和胞质去除对山羊孤雌胚体外发育的影响

为优化山羊核移植方案，实验研究了细胞松弛素B(cytochalasin-B，CB)处理和胞质去除对山羊孤雌胚体外发育的影响。将山羊MⅡ期卵母细胞用7.5 μg/mL CB分别处理5、10、15、20和30 min(实验Ⅰ)，处理后分别去除1/4～1/2的细胞质(实验Ⅱ)，并在每个实验中设对照组(不做任何处理)，孤雌激活后，用碘化丙啶和Hoechst 33258 对囊胚ICM细胞及TE细胞进行双染色，分别记录内细胞团(ICM)和滋养层(TE)细胞数。结果表明, 实验组Ⅰ及对照组均获得了较高的卵裂率(分别为76.83%～85.50%和86.50%)及较高的囊胚期发育率(分别为57.40%～62.20%和59.80%)，囊胚细胞数及ICM细胞数在各组间无统计学差异(P＞0.05)；实验Ⅱ，随着去除胞质比例的1增大孤雌胚的卵裂率(75.76%～16.07%)、囊胚率(38.67%～6.67%)、囊胚细胞总数(107.15～63.67)及ICM百分率(26.32%～19.37%)呈下降趋势，超过1/3时孤雌胚的发育力显著降低(P <0.05)。实验结果指出，(1)7.5 μg/mL CB在30 min以内对山羊孤雌胚体外发育力无不利影响；(2)胞质去除量控制在1/3以下对孤雌胚的发育影响不大。     

供体细胞不同来源和处理方式对牦牛异种克隆胚胎发育的影响

本文以黄牛卵母细胞胞质为受体,牦牛耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对牦牛异种克隆胚胎发育的影响。结果显示：雄性供体细胞的牦牛异种克隆囊胚发育率显著高于雌性供体细胞（56.6% vs 39.5％,P﹤0.05）,但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对牦牛异种克隆胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻后解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组（54.5％ vs 78.2％,P﹤0.05）,但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异。说明供体细胞的性别对牦牛异种克隆囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对牦牛异种克隆囊胚发育影响很少。     

昆明小鼠胚胎干细胞建系的初步研究

以昆明小鼠（Mus musculus）为材料,利用超数排卵获得小鼠扩展囊胚、孵化囊胚。为了研究小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells,mESC）分离和传代的影响因素,设计两个实验：（1）不同孕期（3．5d或4．5d）的囊胚对胚胎干细胞分离效率的影响;（2）第5代后,不同传代方法（机械法或酶消化法）对mESC传代的影响。结果显示：在3．5d孕期时,胚胎为扩展囊胚,在4．5d时为孵化囊胚,扩展囊胚在贴壁率、原代克隆形成率差异不显著,从在继代培养上显著高于孵化囊胚（P〈0．05）;第5代后用机械法或胰酶消化法传代对mESC的维持没有明显差别,但从克隆的形态上看,酶消化法优于机械法。最后,本研究从扩展囊胚组中成功获得了一株mESC,该mESC碱性磷酸酶染色呈强阳性,经RT-PCR分析显示表达Oct4、Sox2,核型为正常40XY。     

小鼠卵母细胞去核方案的优化

为了优化小鼠卵母细胞去核方案，本研究对比了透明带磨口刺入和透明带直接刺入两种去核方法（分别简称磨口法和刺入法）、蔗糖处理与否、CB的浓度及去核针内径对小鼠卵母细胞的去核效率的影响，及CB浓度对去除部分胞质（不去核）的孤雌胚早期发育的影响。结果：（1）无论是磨口法还是刺入法，添加3％蔗糖和对照组之间的去核成功率及去核操作时间差异均不显著（P>0.05）；（2）CB浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL时，各试验组的操作时间差异不显著（P>0.05），但10μg/mL的CB操作速度最快，磨口法三个试验组间去核成功率差异不显著（P>0.05），刺入法在CB浓度为5μg/mL、10μg/mL时去核成功率显著高于20μg/mL组（P<0.05），磨口法去核成功率显著高于刺入法（P<0.05）；（3）去除部分胞质的孤雌胚卵裂率各试验组之间差异不显著（P>0.05），20μg/mLCB处理组囊胚率显著低于其它处理组（P<0.05）；（4）在CB浓度为10μg/mL的操作液中，分别用内径为10μm、15μm和20μm内径的去核针，各试验组间操作时间差异不显著（P>0.05），15μm内径的去核针操作速度较快，磨口法去核成功率差异不显著（P>0.05），15μm去核针去核成功率较高，刺入法应用20μm去核针的去核成功率显著低于其它组（P<0.05）。结果表明，磨口法在10μg/mL CB和15μm内径去核针条件下提高了去核成功率(90.8%)及去核速度（50sec/个），且不影响孤雌胚的体外发育率。     

诱导幼羔卵泡发育及体外胚胎生产

本文研究了羔羊年龄、运输应激和重复超排对幼羔所获卵母细胞数量的影响,胚胎发育液中添加EDTA对幼羔体外胚胎发育能力的影响。结果表明：6～8周龄组幼羔超排的只均获卵数和可用卵数（60.8枚和58.2枚）显著高于12～14周龄组（27.3枚和26.0枚）（P<0.05）;运输应激不影响幼羔超排所获卵母细胞数量（P>0.05）,但重复幼羔超排会显著降低所获卵母细胞数量（P<0.05）。在胚胎发育液中加入10μmol EDTA可显著提高幼羔体外早期胚胎的发育能力（P<0.05）,并且将部分体外胚胎移植后成功产下健康后代。     

从原始生殖细胞分离昆明小鼠EG细胞及其传代培养

为提高昆明小鼠胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)建系效率，以怀孕8.5～12.5 d小鼠胎儿为材料，比较了胎儿后1/3部位的组织共培养、生殖嵴共培养、差速贴壁和穿刺生殖嵴4种分离胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的方法以及不同传代方式对EG细胞克隆的影响。结果表明：生殖嵴共培养和差速贴壁方式获得了较好分离EG细胞的效果，与其它两组比较差异显著；手工传代方式与连同成纤维细胞一起消化的传代方式相比获得了较高传代比率。对所分离EG细胞经形态观察、AKP染色和体外分化能力检测，证实其符合小鼠EG细胞的集落状生长、细胞未分化特性及细胞多能性等特征。     

供体细胞种类对牛核移植效果的影响

供体细胞种类对牛卵母细胞核移植效果影响的研究结果表明,颗粒细胞的核移植效果与成年牛成纤维细胞无显著差异(19.8%vs 17.3%,P>0.05);胎牛成纤维细胞核移植囊胚发育率高于成年牛成纤维细胞(24.2%vs 14.0%,P<0.05);血清饥饿处理的胎牛成纤维细胞(休眠细胞)与高血清培养(非休眠细胞)的胎牛成纤维细胞核移植效果差异不显著(18.8%vs 18.6%,P>0.05),表明胎牛成纤维细胞血清饥饿处理没有必要。     

Involvement of proteins in cloud instability of shamouti orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] juice.

The present study provides evidence for the involvement of protein in cloud instability of natural orange juice. No heat-coagulable proteins were found in the serum. Insoluble cloud matter (ICM) was heat-flocculated following enzymatic pectin degradation (EPD). The degree of flocculation depended on temperature (from approximately 50 to 75 degrees C) and was highest at pH 3.5. The fresh juice contained about 6.5 and 1.8 mg mL(-1) of ICM and alcohol-insoluble solids of the serum (AISS), respectively. The ICM and the AISS contained, respectively, proteins (182+/-14 and 119+/-3 microg mg(-1)), galacturonic acid (37+/-6.6 and 175+/-1 microg mg(-1)), and neutral sugars (350+/-44 and 338+/-22 microg mg(-1)). EPD resulted in removal of a marked portion of the pectin and was accompanied by partial removal of neutral sugars (mainly glucose and galactose) and some proteins from the pectic polymer in both AISS and ICM. Under electrophoresis, proteins of the AISS included bands in the range of 20-52 kDa and 10-14 kDa and those of the ICM at 22 and 50 kDa.