哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系orf160的克隆及遗传转化

以哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系及其保持系、恢复系为材料,克隆并测序线粒体功能基因的侧翼序列。通过生物信息学分析,在atp4下游发现一个哈克尼西棉细胞质不育系特有的orf160。orf160全长480 bp,N端与atp6序列部分同源,C端序列与核序列部分同源;编码的159个氨基酸序列,与膜蛋白、细胞周期蛋白具有部分同源性。以含有线粒体导肽的GFP瞬时表达载体转化后,在洋葱表皮的细胞膜上观察到绿色荧光,表明线粒体定向载体正常表达。构建酵母和植物表达载体,分别转化酵母、烟草和拟南芥;同对照相比,转基因酵母菌斑畸形且生长缓慢;转基因拟南芥和烟草种子大部分畸形,T₁和T₂代植株的结实率和种子发芽率降低,花粉着色比野生型浅。结果表明,orf160基因的表达影响受体正常发育。     

陆地棉(Gossypium hirsutum)光敏色素B基因(GhPHYB)克隆及其生物信息学分析

本研究依据已公布的雷蒙德氏棉基因组测序结果,采用同源克隆的方法,以陆地棉TM-1幼苗为材料,利用RT-PCR技术克隆得到陆地棉光敏色素B基因(Gh PHYB)的c DNA序列。结果显示:该基因ORF全长3 582 bp,编码1 194个氨基酸;通过与已知的拟南芥光敏色素B氨基酸序列比对及蛋白结构预测,发现该基因包含植物光敏色素完整的结构,与烟草、拟南芥、水稻、小麦和玉米的氨基酸序列相似性分别为87.2%、77.9%、74.5%、74.5%和54.6%。同时,本研究还构建了Gh PHYB基因的RNAi干涉载体用于转化棉花,并通过构建棉花PHYB RNAi突变体了解陆地棉PHYB基因对棉花株型、开花期、产量、棉纤维品质、抗逆性等方面的调控作用。研究结果可为该基因今后应用于棉花生产奠定基础。     

拟南芥低叶绿素荧光LCF3基因的克隆与功能分析

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。本研究借助叶绿素荧光成像仪, 从拟南芥EMS诱变突变体库中筛选到一株低叶绿素荧光突变体lcf3-1 (lower chlorophyll fluorescence 3-1)。遗传分析表明lcf3-1突变体为单基因隐性突变。突变基因图位克隆结果显示LCF3是PsbW的等位基因。另外, LCF3基因的T-DNA插入突变体及功能回补转基因植物的叶绿素荧光分析结果, 均证明LCF3基因突变导致拟南芥叶绿素荧光F_v/F_m值降低。进一步实验证明LCF3蛋白定位于叶绿体, 且LCF3基因在植株中普遍表达。PsbW蛋白可能细微调整PSII-LHCII超复合体的组装及稳定。     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

植物天然免疫性研究进展及其对作物抗病育种的可能影响

植物定植在充满各种病原菌的环境中却能健康生长,显示其拥有一套免疫系统以应对病原物的侵染。最近,人们发现植物免疫系统至少包括2个层次：第一层为病原相关分子模式(PAMP)激发的免疫性(PTI),即植物通过细胞表面模式识别受体(PRRs)对病原菌的PAMPs进行分子识别,从而启动植物的防卫反应;第二层为病原菌效应子激发的免疫性(ETI),即有些毒性强的病原菌通过产生效应子(effectors)来抑制PTI,从而突破植物的第一道防线,而植物又进化出新的分子受体(例如R基因编码的NBS-LRR蛋白质)以侦察病原菌效应子并启动第二道防卫反应。数亿年来,病原菌的侵染和植物的防卫交替进行,促进了病原菌和植物基因组的共进化。最新的研究还发现,黄单胞杆菌TAL effectors和寄主植物DNA 的相互识别中,利用了精准的分子密码。TAL effector类蛋白识别植物靶基因的启动子序列,识别模式是2个氨基酸识别一个核苷酸。通过这种识别,TAL effector操控植物靶基因的表达,引起寄主植物的感病或抗病反应。上述抗病分子机理研究的突破,将对植物抗病育种产生重要影响。     

日本科学家发现植物防病新机制

正日本京都大学、德岛大学等组成的联合研究小组最近发现,植物被病原体感染时,其细胞会增强糖的吸收活性,以此来回收细胞外的糖,阻止病原体摄取糖分。研究小组在最近一期《科学》杂志上发表论文称,他们使用植物模型拟南芥对植物的糖吸收与病原菌抵抗性关联进行了试验。拟南芥的糖吸收主要由STP1和STP13两个糖转运蛋白进行。实验发现,与野生植物相比,STP1和STP13蛋白基因被破坏的植株抵抗细菌能力下降,显示糖吸收与细菌抵抗性相关。     

金黄色葡萄球菌对小尾寒羊乳腺组织TLR2表达的影响

Toll样受体能够识别细菌等病原微生物及介导炎症反应信号通路,在先天免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。为了解Toll样受体2(TLR2)在小尾寒羊正常乳腺组织及由金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎乳腺组织中的表达情况,探讨TLR2在金黄色葡萄球菌乳腺炎致病过程中的作用机制及乳腺上皮细胞在乳腺免疫防御中所起的作用,采用qRT-PCR技术和免疫组织化学染色(IHC)法检测了正常小尾寒羊及金黄色葡萄球菌乳腺炎病理模型小尾寒羊乳腺组织中TLR2基因mRNA及其蛋白的表达情况。结果显示,小尾寒羊正常乳腺组织、金黄色葡萄球菌感染乳腺组织均有TLR2 mRNA及其蛋白表达;但金黄色葡萄球菌感染后乳腺组织中TLR2基因及TLR2蛋白显著高于正常乳腺组织,且感染后48 h TLR2 mRNA和TLR2蛋白相对表达量最高(P0.05),96 h TLR2 mRNA和蛋白相对表达量较48 h显著降低(P0.05),正常对照组TLR2的相对表达量最低。通过免疫组织化学染色发现,正常乳腺组织中TLR2蛋白主要定位于乳腺腺泡上皮,而感染金黄色葡萄球菌后乳腺组织中TLR2蛋白主要表达在乳腺腺泡腔中脱落的乳腺上皮细胞和以淋巴细胞为主的炎性细胞上。结果表明,乳腺感染金黄色葡萄球菌后,乳腺上皮细胞是病原菌作用的靶标,通过上调表达TLR2识别病原菌,激发先天免疫。     

小麦TaVIP1家族基因克隆、分子特性及功能分析

植物VIP1蛋白(Vir E2 interacting protein 1)与农杆菌侵染植物后T-DNA在细胞内的转运有关,影响植物转化效率,但还未见有关小麦中VIP1基因研究的报道。本研究利用in silico技术从普通小麦中克隆了TaVIP1家族基因,该家族基因全部由4个外显子构成,编码产物相似性高,与拟南芥AtVIP1蛋白质序列相似性仅为50.7%~51.4%。Southern杂交结果表明,TaVIP1基因在小麦基因组中存在3个拷贝。根据小麦3个TaVIP1基因的差异序列设计特异引物,以四倍体小麦Langdon与中国春D组染色体代换系为材料进行PCR检测,结合生物信息学分析,将小麦3个TaVIP1基因分别定位在4AL、4BS和4DS染色体上。亚细胞定位分析表明,TaVIP1蛋白分布于细胞膜、细胞质和细胞核中。农杆菌转化烟草,过表达TaVIP1基因降低了烟草转化效率。小麦TaVIP1基因编码的氨基酸序列与拟南芥AtVIP1基因及烟草NtVIP1基因编码的氨基酸序列相似性很低,这可能是小麦农杆菌转化效率低的原因之一。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

鸡TLR3基因序列特性分析

TLR3 是发现的TLR家族中识别dsRNA 的唯一成员,越来越多的数据显示TLR3基因具有重要的抗病毒感染的功能,而关于鸡TLR3的研究较少.本研究通过生物信息学进行了鸡TLR3基因的序列特性分析.结果表明,鸡TLR3至少有两种转录产物,均包含4个编码外显子,一种预测1个896氨基酸蛋白,另一种为缺失大部分外显子3的...     

喜树中ABA转运蛋白基因CaABAT的克隆及生物信息学分析

以喜树叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增喜树中的ABA转运蛋白基因CaABAT全长序列,并克隆到pGMT载体中,序列分析表明,CaABAT基因4 377 bp,编码1 458个氨基酸,等电点为7.82,分子量约为164.8 KD,且该基因与拟南芥中ABA转运蛋白基因At ABCG40氨基酸序列同源性高达73%,并将该序列提交至GenBank(No.KY882555)。该蛋白的二级结构中α-螺旋为49.45%,β-折叠为11.04%,无规则卷曲39.51%,定位细胞的质膜上。且该蛋白基因功能分类体系(Gene ontology)分析显示其具有ATPase依赖的跨膜转运活性,可能参与细胞内如含氮化合物代谢过程。然后分别分段导入至酵母表达载体pDRGAL与植物表达载体pBIGD中,构建重组质粒pDRGAL-CaABAT和pBIGD-CaABAT。最终为探究CaABAT转运ABA功能以及研究其对植物次生代谢调控奠定基础。     

拟南芥bZIP1转录因子通过与ABRE元件结合调节ABA信号传导

ABA作为一种重要的植物激素和生长调节剂,介导了高等植物在营养生长阶段对各种外界环境的响应和适应。bZIP类转录因子可以通过ABA依赖途径和ABA非依赖途径调节植物的生长发育和对非生物胁迫的耐性。本研究通过AtbZIP1 T-DNA插入突变的拟南芥植株ko-1 (SALK_059343)和ko-2 (SALK_069489C)在ABA处理后的表型实验,验证了AtbZIP1参与ABA依赖的信号传导通路。采用“三引物法”,分别在DNA水平和RNA水平通过PCR和RT-PCR验证了AtbZIP1基因在拟南芥突变体中的沉默效果。定量分析数据表明,在种子萌发阶段,经过0.6 μmol L^–1 ABA和0.8 μmol L^–1 ABA处理后,AtbZIP1缺失突变体拟南芥植株萌发率和叶片展开/绿色率比野生型植株高,在幼苗生长阶段,经过50 μmol L^–1 ABA处理后,AtbZIP1缺失突变体拟南芥植株根长比野生型植株长。为了确定AtbZIP1基因参与ABA信号传导是否依赖于ABRE元件,在大肠杆菌中表达了AtbZIP1 HIS6融合蛋白,并设计了核心序列为CACGTG的ABRE元件。凝胶阻滞电泳结果表明AtbZIP1融合蛋白可以与ABRE元件特异性结合。半定量RT-PCR分析表明,AtbZIP1基因的缺失改变了下游的ABA响应基因的表达。该结果表明AtbZIP1可以通过与ABRE元件结合调节植物对ABA处理的敏感性和下游ABA响应基因的表达,从而参与植物的ABA信号传导通路。     

百脉根ACC氧化酶基因LcACO1的克隆及序列分析

植物激素乙烯参与植物生长发育多个生理过程的调控。ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键合成酶。本研究依据其它物种ACC氧化酶序列信息设计简并引物,并结合RT-PCR和快速扩增c DNA末端技术从牧草百脉根中首次克隆到ACC氧化酶基因的全长c DNA序列,命名为LcACO1。LcACO1全长c DNA为1 012 bp,具有一个924 bp ORF可编码307个氨基酸残基。生物信息学分析表明,LcACO1是含有Fe2+依赖的加氧酶结构域的稳定亲水蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与其它植物中的ACO蛋白进行同源性比对显示,LcACO1蛋白与鹰嘴豆中ACO蛋白的一致性高达90%。实时荧光定量PCR表明,LcACO1基因在百脉根不同组织器官中差异表达,根中表达量最高,推测其主要在根的生长发育调节方面发挥作用。     

甜杨抗冻转录因子ICE1基因的in silico克隆及其分析

ICEl基因编码类似MYC的bHLH转录因子,可特异地结合到CBF3启动子的MYC作用元件并诱导CBF/DREB1下游基因的转录表达.本文采用电子克隆的方法,以拟南芥ICE1蛋白序列为信息探针,利用杨树EST数据库和毛果杨基因组序列拼接的结果,设计引物并通过RT-PCR从甜杨克隆了杨树的第一个ICE1基因.其cDNA长1 706 bp,含有完整的开放阅读框,可编码543个氨基酸的MYC类蛋白.编码蛋白序列含有bHLH区,核定位信号(NLS)区,富S区和转膜区各1个.Blast分析表明,cDNA序列及其推导的氨基酸序列均与拟南芥和芥菜的ICE1存在着较高的同源性,说明所获得的cDNA可能是甜杨ICE1基因(PsICE1,DQ481236).通过网络服务器平台进行PsICE1的功能预测,结果显示PsICE1含有bHLH保守功能域,具有多个磷酸化位点和跨膜区域.另外,ICE1的电子表达谱分析结果发现,ICE1几乎可在植物中整株表达,在多种组织和不同发育过程均表达,这也在一定程度上说明了ICE1是组成型表达,以及ICE1可能在植物的生长发育中也起着重要作用.     

草莓SBP基因家族生物信息学初步分析

为了研究草莓SBP基因家族的功能,利用多种生物信息学软件,对SBP蛋白序列的系统发生和基因组定位进行分析,对其氨基酸组成成分、理化性质以及二、三级结构进行分析和预测等。结果表明草莓16条SBP蛋白序列与拟南芥16条SBP蛋白序列一起分成了3个亚族,说明拟南芥与草莓SBP基因间具有较高的保守性。基因组定位发现16个SBP基因分布在6条染色体上。研究还发现不同亚族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异,而它们的二级结构主要以随机卷曲为主,三级结构相似。SBP基因家族在植物的生长、发育等多个方面起重要作用,本实验结果为草莓SBP基因家族的进一步功能分析提供了重要研究基础。     

陆地棉GhCRE1影响种子萌发初探

为明确陆地棉细胞分裂素受体基因(GhCRE1)在调控植物生长发育中的功能,为研究陆地棉GhCRE1基因调控种子萌发的分子机理提供材料,进一步从分子水平上提高种子萌发率,通过克隆陆地棉GhCRE1基因,利用基因过表达技术将该克隆片段连接至含Ubiquitin启动子的pCUbi1390载体上构建该基因的过表达载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计拟南芥CRE1基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,从而构建拟南芥CRE1基因靶向敲除载体。将以上2种载体转化农杆菌,使用花序浸染法,以拟南芥为受体材料创建GhCRE1过表达株系及基因编辑功能缺失突变体。接着利用PCR技术和qPCR技术筛选鉴定获得过量表达的GhCRE1拟南芥株系及CRE1功能缺失的拟南芥株系并收获种子,经过对比统计收获的种子与野生型种子在1/2MS培养基上的萌发势进行表型分析,进一步明确陆地棉GhCRE1基因影响种子萌发的功能。结果显示,本研究成功获得了拟南芥GhCRE1过表达株系及CRISPR基因编辑功能缺失突变体株系,且通过数据整理后发现,在种子萌发第2天时,相比野生型,2个过表达转基因株系萌发势分别提...     

小麦TaROP2基因在生长发育中生物学功能的初步鉴定

植物ROP(Rho-like GTPases from plants)蛋白是小GTP结合蛋白Rho家族的成员之一,参与调控花粉管的极性伸长、根毛的发育、细胞骨架的重排、细胞发育与形态建成、细胞的内膜运输等。为探索ROP蛋白参与小麦生长发育过程中的作用,我们克隆了小麦TaROP2基因,利用生物信息学方法对TaROP2氨基酸序列中的保守结构域进行了分析。采用荧光定量方法,我们发现TaROP2基因在小麦幼苗分生组织中表达量相对较高。亚细胞定位分析结果表明,小麦TaROP2蛋白定位于细胞膜和细胞核。我们还构建了TaROP2基因的植物过表达载体pGWB6-TaROP2,并获得拟南芥异源过表达目的蛋白的转基因植株。表型分析发现TaROP2基因参与拟南芥侧根形成和气孔发育。该研究为研究小麦TaROP2基因在生长发育中生物学功能,奠定了实验基础。     

三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析

本研究以三色堇(Viola×wittrockiana Gam)为研究材料,采用RT-PCR和RACE等方法克隆可能与其花色形成相关的酪氨酸脱羧酶基因(Tyrosine decarboxylase),并对基因全长进行氨基酸序列的生物信息学分析。结果从三色堇中分离克隆出c DNA全长为1 634 bp的TYDC1和1 575 bp的TYDC2两个同源基因,包含相同的且长度为1 485 bp,编码494个氨基酸的开放阅读框;氨基酸多重序列比对和聚类分析结果表明:三色堇中的TYDC基因编码氨基酸和其他植物相关基因的一致性可达到82.43%,且与麻疯树的亲缘关系较近,达到73%;对TYDC蛋白的结构进行预测发现,TYDC蛋白是一种亲水性的不稳定蛋白,也是一种存在跨膜区域且不存在信号肽的非分泌蛋白;通过亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要在细胞核和细胞质中表达。本研究为揭示三色堇TYDC蛋白的结构功能务实了基础,为进一步研究和验证该基因在三色堇中的表达提供理论依据。     

拟南芥PUB10和PUB11基因抵抗丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株的功能分析

丁香假单胞杆菌Pseudomonas syringae pv tomato(Pst)DC3000是研究植物免疫机制的常用病原菌。为分析拟南芥E3泛素连接酶PUB10、PUB11在免疫中的功能,本研究构建了pub10/pub11双突变体。在分析拟南芥PUB10、PUB11序列相似性和进化关系的基础上,比较了pub10/pub11双突变体和Col-0对Pst DC3000的敏感性、MAPK磷酸化水平、ROS产生的影响,并检测JA信号响应途径和免疫防御相关的部分代表性基因的表达量。结果表明PUB10、PUB11氨基酸序列高度保守,pub10/pub11双突变体对Pst DC3000的侵染更敏感,侵染后叶片病原菌数目明显增多,MAPK磷酸化水平迅速下降,ROS释放量降低,JA信号响应基因(LOX3,JR2)、免疫防御负调控基因(NIMIN1,WRKY38,WRKY62,RIN4)表达量上升显著高于Col-0,而免疫防御正调控基因(AZI1,EDS1,PAD4,EDS5,FMO1,NPR1)表达量显著低于Col-0。由此推断,AtPUB10、AtPUB11在防御Pst DC3000中起正调控作用,并且存在功能冗余。研究结果为进一步探索PUB10、PUB11调控植物防御的分子作用机制和分子育种提供了依据。     

小麦磷脂酶Dα的基因克隆及其编码序列的生物信息学分析

为获得更多小麦抗逆基因资源,利用RT-PCR方法克隆了磷脂酶D基因(PLD),命名为TaPLDα,并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析.结果表明,TaPLDα开放阅读框为2 394 bp,编码812个氨基酸残基,等电点5.30,分子量为92 kDa.序列分析显示,TaPLDα基因编码的氨基酸序列含有N端C2结构域及2个保守的活性中心.预测TaPLDα蛋白是一个亲水性稳定蛋白且定位于细胞质,其二级结构含28.82％的α-螺旋、20.07％的延伸链、6.03％的B-转角和45.07％的不规则卷曲.该蛋白不存在信号肽,无跨膜区.TaPLDα与水稻、玉米和拟南芥的PLDα氨基酸序列之间具有高度的保守性,进化分析显示,小麦PLDα序列与毒麦、水稻和玉米PLD序列亲缘关系密切.