玉米ZmMGT12基因的表达分析及拟南芥遗传转化

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在植物镁离子吸收、转运、分配中有着重要作用。为了探究一个编码蛋白定位于叶绿体的玉米镁离子转运蛋白基因Zm MGT12的功能,对其表达模式、表达量与叶绿素合成间的相关性进行了分析,同时构建了过表达载体并遗传转化了拟南芥。表达分析表明,Zm MGT12在各组织部位中均表达,其中在叶中的表达量最高,大约是根的13倍;此外,Zm MGT12在叶中的表达受光诱导,且具有昼夜节律模式。相关性分析表明,Zm MGT12在叶中的表达量与叶绿素合成具有一定的相关性。转基因分析表明,过表达Zm MGT12没有改变转基因拟南芥植株的生物量、叶绿素含量、叶绿体中镁离子浓度。本研究分析了Zm MGT12详细的表达模式、表达量与叶绿素合成间的相关性,并构建了其过表达载体并对拟南芥进行了遗传转化,有助于确定其在植物中的功能。     

花生AhPLDα基因植物过表达载体构建及对拟南芥的遗传转化

为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制,以ABA处理的冀花4号花生叶片c DNA为模板,用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段,采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体p Bar-F3上,冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101,利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明,Ca MV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒p Bar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证,表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达,获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明,转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见,AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程,是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。     

GbTCP10基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

TCP转录因子广泛参与植物细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP10基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP10基因pGEM-T Easy-GbTCP10质粒为模板进行PCR扩增,连接至植物表达载体pCAMBIA3301中,再利用冻融法和热激法转到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得海岛棉GbTCP10基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP10前体的植物表达载体amiRTCP10-pCAMBIA3301,本试验结果有助于进一步研究海岛棉GbTCP10基因的生物学功能和棉花纤维发育机制。     

马铃薯StNCED1基因过表达载体的构建及其遗传转化

马铃薯块茎的休眠和发芽对于块茎生产和加工极为重要,延长块茎休眠期有助于降低块茎水分和养分的消耗,从而提高其应用价值。本研究用PCR方法从马铃薯中克隆了9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)编码基因St NCED1,并构建了马铃薯块茎特异表达启动子CIPP驱动的St NCED1基因的植物过表达载体p BIC-St NCED1,然后通过根癌农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种"陇薯3号"获得转化植株,经卡那霉素抗性筛选得到5株抗性苗,PCR检测证明St NCED1基因已整合到马铃薯的基因组中。qRT-PCR检测表明St NCED1基因在转基因植株试管薯中的表达量分别比未转基因的对照增加2.10~8.09倍。该研究有助于培育块茎休眠期延长的马铃薯新种质。     

大豆F3’H基因植物表达载体的构建及拟南芥的遗传转化

通过RT-PCR方法扩增了大豆F3'H基因并构建含大豆荚皮绒毛色基因的重组质粒pBI121/F3'H的植物表达载体,转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株,通过根癌农杆菌介导的方法转化拟南芥.为进一步研究大豆荚皮绒毛色基因(F3'H)作为植物基因工程的报告基因的可能性奠定基础.     

陆地棉GhVP1基因干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化

为进一步探索陆地棉GhVP1基因的功能,本研究以本实验室克隆得到的陆地棉GhVP1基因为模板,经Blast比对,选择长度为347 bp片段作为干涉载体正义、反义序列。利用In-fusion方法构建干涉载体,挑选阳性克隆测序验证,成功构建pBI121-PH::VP1干涉载体。利用农杆菌介导法转化拟南芥,并进行PCR检测,成功获得9株转基因苗,并对获得的T3代转基因拟南芥进行耐盐性分析。结果显示,盐胁迫下,转干涉载体拟南芥的发芽率降低,根长变短,整个生育期的生长受到抑制。研究表明VP基因与植物的耐盐性相关,为进一步研究GhVP1基因及其作用机理提供了参考依据。     

甘蓝型油菜iMyAP9、iMyAP12基因过表达载体的构建及转化拟南芥

诱导型黑芥子酶协助蛋白(iMyAP)往往与黑芥子酶和黑芥子酶结合蛋白一起以复合体的形式存在,对植物的防御系统有着重要的作用。为了研究黑芥子酶协助蛋白在植物响应非生物胁迫方面的功能,通过以pBI121为载体,分别构建了CaMV35S::iMyAP9和CaMV35S::iMyAP12,浸花法转化拟南芥,用卡那霉素对转化植株进行筛选,并对抗性苗进行PCR检测,初步得到67株转基因植株;提取转基因拟南芥中RNA进行RT-PCR表达分析,结果表明,iMyAP9基因和iMyAP12基因在随机挑选的转基因拟南芥中获得了有效的表达。拟南芥转基因植株的获得为进一步探讨iMyAP9基因、iMyAP12基因的生物学功能奠定了基础。     

拟南芥植物型PEPC基因人工小RNA表达载体的构建与遗传转化

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是植物中具有多种生理功能的酶。为探索拟南芥中植物型PEPC基因对模式植物拟南芥脂肪酸含量以及抗逆性等方面的影响,本文构建了同时敲除拟南芥Atppc1、Atppc2和Atppc3基因的人工小RNA（amiRNA）植物表达载体pFGC-amiAtppc123,经根癌农杆菌EHA105介导,用花序浸染法转化拟南芥,成功获得转基因植株。RT-PCR半定量分析表明人工小RNA在转化植株中成功进行了超量表达。该试验为分析拟南芥脂肪酸含量以及抗逆性方面提供了基础材料。     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

水稻OsAAA1基因超表达载体构建及遗传转化

为了构建带Flag标签的OsAAA₁超表达载体,获得阳性转基因植株并分析其OsAAA₁基因表达情况。以日本晴的cDNA为模板,将OsAAA₁克隆至pU1301-Flag载体;重组质粒通过PCR、酶切及测序鉴定正确后,以农杆菌为介导进行遗传转化至日本晴;转基因植株通过分子鉴定正确后,采用Real-time PCR检测OsAAA₁基因的mRNA表达水平变化。成功构建了OsAAA₁-pU1301-Flag重组载体;遗传转化后获得33株转基因植株;通过分子鉴定筛选出26株阳性转基因植株;荧光定量PCR结果分析发现23株阳性转基因植株OsAAA₁基因的表达出现不同程度上调。与日本晴相比,有8株表达量达到30倍以上,其中有5株表达量超过40倍。成功构建了带Flag标签的OsAAA₁超表达载体;遗传转化结果表明OsAAA₁-Flag能整合到日本晴的基因组DNA中,从而使OsAAA₁基因的表达水平增加。本研究为后续通过Flag标签,在水稻植物体内直接挖掘与OsAAA₁互作的功能蛋白奠定了基础。     

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。     

烟草orf25基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

杂种优势的利用可以有效地实现烟草高产、高抗、优质的育种目标,目前,培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。研究发现orf25基因位于线粒体基因组中,与烟草雄性不育密切相关。本研究以烟草雄性不育相关基因orf25为研究对象,根据RNA干扰载体构建原则,将长度为606 bp的orf25基因干扰片段分别以正向、反向连接到大小为190 bp的linker连接片段的两侧,构成发夹结构的RNA干扰载体片段。将RNA干扰载体片段插入到中间载体pET30a上,最后克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建orf25基因的RNAi表达载体。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi转入到烟草保持系中烟90中,经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有18株,转化率为51.4%。结果表明pCAMBIA1301-orf25-RNAi干扰载体已成功转入到烟草中烟90中。     

AtTPS03基因RNA干扰载体的构建及拟南芥转化

本研究以拟南芥DNA为模板,将罗勒烯合成酶AtTPS03基因的一个目的片段克隆到T-载体上.对克隆片段测序后,进行Blast比对,结果目的片段的序列与GenBank上报道的序列同源性达到100%.根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向连到干扰载体pFGC5941查尔酮内含子的两侧,经限制性酶切和PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体P-2AT03.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥.收获的种子在含草丁膦的培养基上筛选抗性苗,通过对抗性苗的PCR检测,已成功获得了12株转基因苗.这些转基因苗为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础.     

GsZFP1基因植物表达载体构建及对苜蓿的遗传转化

从野生大豆中获得的具有耐旱、耐冷特性的锌指转录因子GsZFP1基因,构建到以CaMV35S为启动子、E12为增强子的植物表达载体pCEOM中,以bar基因为筛选标记基因,通过农杆菌介导法将构建的植物表达载体转化苜蓿品种农菁1号的子叶节,用含0.5mg/L草丁磷的筛选培养基进行筛选,获得了70株抗性植株,用PCR检测得到20株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行GsZFP1基因的RT-PCR鉴定,获得3株RT-PCR阳性植株。结果表明,GsZFP1基因在苜蓿中得到表达。     

棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

摘要：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶。本研究采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录。     

ProDH基因反义表达载体的遗传转化

利用农杆菌介导的叶盘法将ProDH基因反义表达载体分别导入番茄品种‘耐运2000’和烟草中,建立并优化了番茄子叶再生体系。同时采用操作简单、再生周期短、转化效率较高的烟草进行了遗传转化体系的建立。试验获得49个烟草抗性芽和177个番茄抗性芽,用特异性引物对其做PCR扩增验证,共获得9个PCR呈阳性的抗性芽,其中7个烟草抗性芽、2个番茄抗性芽,因此证明外源基因已成功转入番茄的基因组中,为进一步番茄转基因工程的研究奠定基础。     

叶用莴苣无缝克隆构建LsE3基因过表达载体和新RNAi载体及遗传转化体系优化

研究旨在应用新技术和新载体构建过表达和沉默载体,优化遗传转化体系,验证生菜LsE3基因功能,探究高温抽薹机制.以pCAMBIA1304和pFGC5941载体为材料,通过无缝克隆构建叶用莴苣转基因载体,并通过筛选培养基配方优化遗传转化体系.试验成功地以pCAMBIA1304为基础,插入源自pFGC5941的dsRNA表达...