利用转录组及iTRAQ技术筛选高油酸油菜抗病相关基因

高油酸油菜和低油酸油菜对菌核病的抗性存在显著差异,为了弄清其分子机理,以一组高油酸油菜近等基因系自交授粉后20~35 d的种子为材料,分别进行转录组和同位素相对标记与绝对定量技术分析。分析了与抗病相关的氧化磷酸化、植物激素信号转导通路和植物病原体互作3个分类,将注释的基因和蛋白进行关联,并对其中可能与抗病相关的基因进行定量PCR验证。结合前人研究发现,基因表达或蛋白表达发生显著变化的基因gi|260505503(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)、gi|226346102(HSR203J类蛋白)、gi|470103214(钙调蛋白类)与抗病相关;而gi|297843222(结合蛋白)、gi|18397961(2-铁,2-硫-铁氧化还原类蛋白)、gi|196052306(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基)、gi|18423437(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(辅酶)1α-复形5)和gi|297794581(激酶家族蛋白)等基因差异显著。     

高油酸油菜成熟期种子转录组分析

为了找出差异基因用于高油酸油菜育种,对两个油酸含量不同的高油酸油菜材料(油酸含量分别为84.4%和56.2%)成熟期种子进行转录组分析和实时荧光定量PCR分析。Illumina Hiseq TM2000测序得到8.09 Gb clean reads,组成52 361个unigene,平均长度为659 bp。比对公共数据库得到48 911(93.41%)个氨基酸序列。鉴定出6 414个在高油酸油菜和低油酸油菜中差异显著的基因,这些基因有1 296个在高油酸油菜中上调表达(20.21%),5 118个下调表达(79.79%),共有2 043个差异基因在119个代谢通路中富集表达。将其中14个与脂肪酸代谢和光合作用相关基因进行荧光定量PCR验证。Bna0799930,Bna0104450和Bna0305890在高油酸油菜中上调表达,其余的下调表达。Bna0501620,Bna0391450和Bna0084310在高油酸油菜中的表达量超过低油酸油菜中表达量2倍以上,分别为4.48倍,4.21倍和2.26倍。这些新发现的差异基因可用于高油酸油菜分子育种研究。     

利用基因芯片技术研究甘蓝型油菜油酸合成中差异表达基因

采用基因芯片技术对甘蓝型油菜高油酸(71.71%)和低油酸(55.6%)材料进行分析,探索油酸的差异表达基因。结果检测到差异表达基因562个,其中上调表达基因194个,下调表达基因368个。以基因芯片中油菜上调基因NM_100489和下调基因NM_130183为材料,用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果,二者完全相符。根据基因芯片的实验结果,采用Go注释系统和数据库查询对562个差异表达基因进行功能注释表明,主要为各种酶类、结合功能、转录调控、代谢等,还有的功能未知或与糖代谢及脂肪酸合成相关,其中丙酮酸激酶、果糖二磷酸、酰基传递/酰基ACP硫脂酶、作用于酯键的水解酶、Δ9硬脂酰-乙酰载体蛋白去饱和酶(ADS1)、Δ9酰基-油脂减饱和酶2(ADS2)、ω-3脂肪酸减饱和酶(fad3)等被鉴定为差异表达基因。     

9个光合作用相关基因在高油酸油菜近等基因系不同生育期中的表达研究

为了明晰与光合作用相关基因在不同油酸含量油菜中的表达,以高油酸油菜近等基因系出苗后7d去根植株、5~6叶期和越冬期的叶片、花瓣和授粉后20~35d的种子为材料,对9个转录组分析得到的差异基因在近等基因系中的表达进行研究。结果发现,在叶片中,除Bna0305890外,其余8个基因在高油酸油菜材料中的表达量均高于低油酸油菜,Bna0104450和Bna0084310的表达量尤其突出。在花瓣中除Bna0391450外,其余8个基因在高油酸油菜材料中的表达量均高于低油酸油菜,Bna0305890的表达量差异较大。在授粉后20~35d的种子中除Bna0104450和Bna0305890外,其余基因在高油酸油菜中的表达量均低于低油酸油菜,Bna0501620和Bna0391450的表达量差异较大。5个时期Bna0104450在高油酸油菜中的表达量均高于低油酸油菜,有望利用其进行高油酸油菜育种材料的早期筛选。     

甘蓝型油菜种子发育灌浆后期的转录组分析

油菜种子发育是产量和品质形成的关键发育阶段,包含了复杂的发育过程和调控网络,有效地解析种子发育的转录调控机制具有重要的意义。以甘蓝型春油菜品种青杂5号为研究材料,利用RNA-seq技术对种子发育的后期(30-DAF,40-DAF)2个发育时间进行转录组测序,筛选差异基因,并利用GO数据库和KEGG数据库注释差异基因功能和可能参与的调控途径。结果表明,从油菜种子灌浆后期的2个时间点的转录组中分别检测到70 850和65 193个表达基因,筛选得到2 654个差异表达基因,其中1 941个基因下调表达,713个基因上调表达,29个基因表达差异倍数|log2Ratio|≥10。GO基因功能分析显示,生物学途径中富集最显著的条目是染色质组装相关的等生物学过程,分子功能方面富集最显著的条目依次是蛋白质代谢、营养库活性等功能类别,而在细胞组件方面富集最显著的条目是染色体相关的等细胞组件。Pathway显著性富集分析显示注释基因最多的途径是次生代谢途径,其次是淀粉、蔗糖代谢途径、苯丙素生物合成途径中的、碳代谢途径和氨基酸生物合成途径。甘蓝型油菜种子发育后期的转录组分析表明,种子发育30-DAF时期次生代谢物、脂质代谢等表达活跃,40-DAF时期逐渐转变为蛋白质、氨基酸生物合成、光合碳代谢、碳代谢等表达活跃,提示油菜种子灌浆后期仍处于复杂的物质与能量代谢调控过程。     

花生油脂合成相关基因的表达谱分析

为研究不同发育时期花生籽仁油脂合成过程中基因表达调控模式,本研究以高油酸、中油花生品系F18和低油酸、低油花生品种‘鲁花6号’为材料,对下针后10、30、40、60 DAP(days after pegging)的花生种子进行表达谱芯片测序。结果表明,130、3556、2783个基因分别在30、40、60 DAP时期差异表达。GO注释和KEGG富集结果显示,差异表达的基因主要富集在脂肪酸合成和光合等代谢进程中,其中FAB2、FAD2、WRI1等主要参与油酸的积累,参与光合作用的基因均为捕光叶绿素a/b结合蛋白,全部上调表达。代谢通路图结果表明,籽仁发育的40 DAP和60 DAP时期,脂肪酸合成途径的基因均上调表达。研究结果为花生油脂代谢的分子机制提供理论基础,同时也为花生品质改良贡献了基因资源。     

PEG胁迫下玉米转录组差异性分析

为了明确玉米响应PEG胁迫的关键表达基因,比较PEG胁迫下玉米基因表达的差异,本实验利用RNA-seq对正常灌溉和干旱胁迫的玉米进行转录本测序和数据分析,共获得12358个差异表达基因,其中5275个基因为上调表达,7083个基因为下调表达。对差异表达基因进行COG功能分类,共得到23个不同的COG功能,其中翻译后修饰,蛋白质转换,伴随蛋白681个,占7.74%;信号传导机制功能有转录本675个,占7.67%;转录506个,占5.75%。KEGG通路显著富集到光合作用-天线蛋白、光合生物的固碳作用、卟啉和叶绿素代谢、脂肪酸降解、精氨酸和脯氨酸代谢、磷酸肌醇信号等生命代谢途径。     

甘蓝型油菜皖油20号种子不同部位油脂合成的转录调控分析

甘蓝型油菜是主要的油料作物之一,种子含油量一般在35%～50%。油脂主要储存于油菜种子胚中,胚主要由子叶[包括外子叶(OC)和内子叶(IC)和胚轴(EA)]组成。低芥酸油菜品种皖油20号(WY20)种子不同部位的含油量存在显著差异。WY20的胚中, OC含油量最高, EA含油量最低。同时,脂肪酸组成在种子不同部位也存在差异, EA中棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)及二十碳酸(C20:0)的比例均显著高于子叶,特别是C16:0在EA中的比例约为子叶的2倍。而油酸(C18:1)及二十碳烯酸(C20:1)在子叶中的比例均显著高于EA。硬脂酸(C18:0)在OC中含量最低,在IC和EA中无差别。亚麻酸(C18:3)则在OC中含量最高,在IC和EA中无差异。对发育34d种子的IC、OC和EA进行转录组分析,将三个部位中基因表达定量分析的结果两两比较后共发掘出7192个差异表达基因,其中OC和IC之间差异表达基因数目较少,子叶和EA间有较多的差异表达基因。子叶和胚轴中的差异表达基因富集在光合作用、脂肪酸代谢和叶绿素合成等生物学过程。基因功能注释显示,差异表达基因中有355个和脂质代谢相关,且多集中在质体中脂肪酸从头合成途径。本研究表明油脂合成途径关键基因的差异调控是造成油菜种子不同部位含油量和脂肪酸组成差异的主要因素。     

基于FAE1和FAD2基因的油菜种子脂肪酸生物合成遗传调控

脂肪酸延伸酶1基因FAE1和Δ~(12)-脂肪酸脱饱和酶基因FAD2是植物脂肪酸生物合成途径中的两个关键酶基因,在同一甘蓝型油菜品种CY2中对这两个关键酶基因进行单表达和双表达遗传调控获得五种不同类型的具有相同遗传背景的转基因株系。本研究分析比较了种植于相同环境条件下的五类转基因株系及野生型对照的种子脂肪酸组成和含油量,结果表明,两基因单独和双重调控可显著改变油酸、亚油酸、亚麻酸、花生烯酸和芥酸等多种脂肪酸含量,其中两个内源目标基因同时沉默种子中的油酸含量从20.5%提高到了82.8%,拟南芥FAE1基因籽粒特异表达种子中的芥酸含量由43.9%增加到了60.2%。与野生型对照相比,五类转基因种子中的十八碳不饱和脂肪酸相对比率和油酸脱饱和比例均发生了显著变化。此外,增强FAE1基因表达后种子含油量有所提高,而沉默两个目标基因的表达则使种子含油量降低,表明两个关键酶基因调控对油脂合成与积累也产生一定影响。     

DOF转录因子AtDof1.7 RNA干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化

DOF (DNA binding with one finger)转录因子是植物特有的转录因子家族,含有一个独特的富含Cys残基的单锌指DNA结合区域,在植物生长发育中参与多种生物学过程。本研究根据拟南芥AtDof1.7基因(GenBank登录号为AT1G51700)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtDof1.7基因片段,将AtDof1.7基因正向反向分别插入表达载体的相应位置,构建成AtDof1.7基因的RNA干扰载体pADOF1。利用改良的floral-dip方法将干扰载体pADOF1成功转入野生型拟南芥,经草甘膦抗性筛选和PCR检测获得5株阳性转基因植株。利用RT-PCR技术和气相色谱法分别分析了AtDof1.7基因的表达和种子脂肪酸组成,结果表明5株转基因植株中AtDof1.7基因的表达量不同程度低于野生型植株,种子油酸含量明显上升,亚麻酸含量明显下降,说明AtDof1.7转录因子与拟南芥种子脂肪酸代谢途径有一定的关系,为进一步研究其在脂肪酸代谢过程中的调控作用以及在油菜中研究该类转录因子的功能奠定了基础。     

向日葵HaFATB基因的生物信息学和表达分析

向日葵油中不饱和脂肪酸主要为油酸和亚油酸,当不饱和脂肪酸总量一定,油酸含量越高,营养价值和品质越好,且不易氧化腐败。FATB编码脂肪酸-酰基载体蛋白硫酯酶B,将脂肪酸链从酰基载体蛋白中释放出自由的脂肪酸。本研究对向日葵HaFATB编码蛋白进行了生物信息学的分析,预测HaFATB编码蛋白为碱性蛋白且为亲水性蛋白,蛋白二级结构为无规则卷曲,预测亚细胞定位于叶绿体。系统进化分析发现,HaFATB基因与同属菊科的青蒿(Artemisia annua L.) FATB进化关系最近,序列相似性高达88%。HaFATB组织特异性表达分析结果表明,HaFATB在茎、管状花和根中表达最低,其次是叶和舌状花,在部分发育时期的种子中表达较高,HaFATB在高、低油酸向日葵种子不同发育阶段表达变化趋势明显不同,但均在种子发育前期表达较低,总的来说低油酸种子中表达量要高于高油酸种子,因此认为Ha FATB的表达量很可能影响着向日葵种子的油酸含量。     

六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶（FAD2）假基因的克隆和分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料,采用PCR方法克隆并分析了56个FAD2基因克隆和47个FAD2基因cDNA克隆,从中发现6个新的FAD2基因拷贝。它们与公布的甘蓝型油菜FAD2基因(AY577313)具有87%以上的同源性,没有内含子,在开放阅读框中存在1~12个终止密码子,其中有2个拷贝具有转录功能。将这6个FAD2基因拷贝在酿酒酵母中进行体内表达实验,通过气相色谱检测脂肪酸组成证明其不具备油酸脱氢酶功能,与对照相比,也没有改变酵母体内脂肪酸组成。由此推测这6个FAD2基因拷贝为假基因。     

抗感菌核病甘蓝型油菜近等基因系盛花期叶片转录组比较分析

为了研究甘蓝型油菜与菌核病病原核盘菌互作的分子机制,挖掘分别与甘蓝型油菜抗、感病相关的基因,以高抗菌核病品种湘油15(Xiangyou 15)及其感病的近等基因系98C40NL为材料,利用转录组测序技术(RNA-Seq)对2个品种盛花期叶片接种核盘菌前及接种后12,24 h差异表达基因进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对部分基因表达进行验证。测序得到34.16 G Clean bases,6个样本中共鉴定出78 582个基因。相对于高感品种,湘油15在3个时间点共有1 296个基因下调表达,1 495个基因上调表达; 54个基因在3个时间点都表现显著差异,其中18个基因在3个时间点都下调,27个基因在3个时间点都上调。差异基因主要富集在氧化还原、植物激素信号转导、钙信号通路、苯丙烷类代谢、次生代谢产物合成等途径。通过荧光定量PCR验证,BnaA03g09060D、BnaA01g26640D、BnaA03g09090D、BnaA04g12120D、BnaA01g26920D 5个基因在高抗品种的表达显著高于高感品种,可能与寄主植物防御核盘菌的侵染有关;BnaA06g10010D、BnaA09g16180D、BnaAnng19580D、BnaC01g40400D、和BnaC06g05340D 5个基因则在高感品种中表达显著高于高抗品种,可能与核盘菌感病受体相关。研究结果为解析油菜与核盘菌互作机理及挖掘菌核病抗性和受体基因提供参考依据。     

结合RNA-seq分析和QTL定位筛选甘蓝型油菜萌发期与铝毒胁迫相关的候选基因

随着土壤酸化程度的加剧,铝毒害已成为影响种子萌发质量和作物产量的重要胁迫因子之一。为研究铝毒对油菜种子萌发过程影响的分子机理,本文采用RNA-seq技术对耐铝品系18D300和敏铝品系27011进行转录组分析,共检测到9344个显著差异表达基因[|log₂(fold change)|≥1和FDR≤0.05],其中4406个DEGs基因上调, 4938个DEGs下调。GO富集分析发现,差异表达基因主要与氧化反应、细胞碳水化合物代谢过程、转运蛋白活性等相关。KEGG富集分析表明,差异表达基因主要富集于苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、MAPK信号通路-植物、植物-病原体相互作用、植物激素信号转导等途径。此外,通过整合RNA转录组测序和铝毒胁迫下油菜萌发期根系相关性状的QTL定位结果,共筛出44个差异表达基因(10个下调和34个上调),这些基因主要与氧化应激、渗透调节、细胞壁修饰、转运蛋白、激素信号传导等功能有关。     

桃叶片低温响应转录组分析

抗寒是桃育种工作重要的目标性状,受多个基因的调控,转录组测序是对特定生理条件下的转录本进行测序分析,用以深入探究桃叶片低温响应的分子机制。以熊岳巨桃的叶片为试验材料对4℃低温(LT)处理下和正常叶片(RT)进行转录组测序分析。利用DESeq2进行差异表达分析,获得72个上调差异表达基因和3个下调表达基因。KEGG代谢通路分析差异表达基因的代谢通路,并进行蛋白的互作预测。结果显示,低温处理的叶片呈现卷曲、变黄和失水的生理状态,差异代谢基因主要富集在植物病原体互作、MAPK信号通路和次生物质代谢积累等途径。MYC2、SPCH和Pti4～6转录因子可能在响应冷胁迫中调节低温带来的伤害中起到重要作用,MYC2和CBF蛋白预测相互作用,且分别与多个蛋白互作。本研究表明,有多个代谢途径共同响应桃叶片的低温胁迫,还预测到了可能在冷反应调节途径中起到关键作用的相关转录因子,为探究桃响应冷胁迫的分子机制打下基础。     

不同施氮水平下甘蓝型油菜发育种子中基因表达谱差异分析

氮肥是油菜生长发育需要的重要营养元素之一, 增施氮肥可提高油菜籽产量和蛋白含量, 但降低种子含油量。筛选氮肥不敏感油菜基因型、发掘氮肥响应基因及调控网络研究尚不多见。本研究以油菜中双11和德国品种Parter为材料, 设置4个氮水平(施用尿素0、90、180和270 kg/hm^–2), 随机区组试验, 利用Agilent油菜基因芯片在全基因组水平分析施氮(180 kg/hm^–2)和未施氮(对照)处理授粉25 d种子的基因表达谱。结果显示, 随着施氮量的增加, 种子含油量降低, 而蛋白含量增加, 且在2个品种中的变化程度不同, Parter含油量的下降水平比中双11显著。处理与对照相比, 中双11和Parter分别有827个和3 676个差异表达基因, 明显存在基因型的差异; 2个品种中共同的差异表达基因有278个, 其中上调表达的151个, 下调表达的80个, 差异表达在10倍以上的基因有4个。根据基因功能注释, 2个品种中的差异表达基因分子功能主要为催化、结合和转录调节活性, 参与细胞、代谢和应激等生物过程, 约50%的差异基因未得到功能注释。选择8个差异表达基因进行实时荧光定量PCR分析, 结果显示2种方法的检测结果吻合率为94%, 表明检测结果具有一定的生物重复性。本结果为进一步筛选油菜氮肥敏感基因型、开展氮应答机制研究提供了有用信息。     

金花葵开花前后差异基因及代谢物分析

为深入研究金花葵花朵开花前后基因和代谢物的变化,利用转录组学和代谢组学技术相结合的方法对金花葵花蕾和花朵进行检测。结果显示,通过转录组分析鉴定了206 636个Unigenes,筛选出42 618个差异表达Unigenes,其中包括63个差异表达转录因子家族,24个转录调节因子家族。GO分析结果显示,差异表达基因主要富集于囊泡介导的逆行运输等生物学过程。KOG功能注释显示,差异表达基因功能以通用功能预测居多,其次是信号转导机制、翻译后修饰蛋白周转以及碳水化合物的转运和代谢。差异表达基因KEGG富集分析表明,差异基因主要富集于代谢、植物激素和信号转导、淀粉和蔗糖代谢等代谢通路。通过代谢组学检测,筛选到差异显著代谢物135个,主要包括脂类、氨基酸及衍生物和黄酮类等,KEGG富集分析表明,差异代谢物主要富集于甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成和次生代谢产物的生物合成-未分类等过程,其中,缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解代谢通路同时出现在了基因和代谢物KEGG代谢通路富集Top 20中。     

转录组解析外源ABA对玉米脱水速率的影响

为了探明迪卡517、郑单1002喷施外源ABA后脱水速率变化的分子机制,发掘影响脱水速率的关键差异表达基因及代谢通路,利用Illumina HiSeq~(TM)2500测序仪分别对喷施ABA前后迪卡517(脱水速率较快)和郑单1002(脱水速率较慢)的穗位叶进行高通量转录组测序。原始序列经过质量控制、基因组比对、测序饱和度、基因覆盖度及冗余序列分析后进行基因功能注释。结果显示,迪卡517外源ABA处理与正常生长条件对比组检测到1 732个差异表达基因,其中1 251个为上调表达基因,481个为下调表达基因;郑单1002外源ABA处理与正常生长条件对比组检测到52个差异表达基因,其中24个为上调表达基因;迪卡517外源ABA处理与郑单1002外源ABA处理对比组检测到3 867个差异表达基因,其中1 946个为上调表达基因。不同对比组中筛选到差异表达基因GO分类情况、COG基因产物分类、KEGG代谢通路分析不同。转录因子分析共获得多个重要的转录因子家族,主要有AGC蛋白激酶家族、AP2/ERF转录因子家族、ARID转录因子、AUX/IAA转录因子家族、Alfin-like转录因子、Aur转录因子家族、B3转录因子家族、BBR-BPC转录因子家族、BES1转录因子、BUB转录因子、C2C2-CO-like转录因子等。Zm00001d035000、Zm00001d042063、Zm00001d045314等共同差异表达基因均在迪卡517和郑单1002中表达。对所有检测到的差异表达基因GO分类分析获得73个差异表达基因与水分代谢相关,推测这些基因作为外源ABA调控的下游基因起作用。     

锌胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴长的全基因组关联分析

锌(Zn)是重要的微量元素之一,但土壤中过量的锌累积会影响植物的生长发育。本研究以不同遗传来源的140份甘蓝型油菜为材料,利用芸薹属60K SNP芯片对锌胁迫下(30 mg L-1)甘蓝型油菜发芽期相对下胚轴长(RHL)进行全基因组关联分析,筛选与甘蓝型油菜发芽期下胚轴长度显著关联的SNP位点及候选基因。群体结构分析表明,供试的140份甘蓝型油菜被分为2个亚群,其中89%材料间亲缘关系小于0.1,说明供试群体材料亲缘关系比较远。GWAS分析共检测到8个与RHL显著关联的SNP位点,单个SNP位点分别可解释22.0%~33.2%的表型变异。转录组分析获得的差异基因GO富集分析结果表明,上调表达基因主要参与氧化还原反应、离子转运、胁迫反应、防御反应和硫化合物转运。综合全基因组关联分析和转录组测序结果,共鉴定到19个与锌胁迫相关的候选基因,包括编码锌指蛋白家族成员(B-box型和ZFP1)、谷胱甘肽转移酶GSTU21、过氧化物酶家族蛋白、ABC和MFS转运蛋白及细胞壁相关激酶蛋白和一些重要的转录因子(BnaA07g27330D、BnaA02g30270D、BnaA07g27840D、BnaA07g31860D和BnaA07g28000),为深入解析油菜锌胁迫分子机制提供了参考。     

茶饼病诱导感、抗茶树品种的基因表达谱分析

为揭示茶树被茶饼病危害诱导的防御反应机制,本研究选择抗病和感病茶树品种为材料,通过转录组测序和数字表达谱分析茶树叶片被茶饼病危害前后的基因表达差异。结果显示,共筛选出差异表达基因974条,其中共有的为122条,抗病品种中特异364条,感病品种中特异的为488条。对差异表达基因进行分析发现,茶饼病危害主要影响了茶树体内代谢途径、内质网蛋白质加工、次生代谢产物的生物合成、植物病原相互作用、植物激素信号转导途径、淀粉与蔗糖的代谢、苯丙醇生物合成等通路中关键基因的表达水平,这些差异基因包括抗病蛋白基因(R protein)、水解酶基因、细胞壁加固基因、转录因子基因、植物激素及其信号转导基因、次生代谢和氧化酶类、转运蛋白等。利用RT-qPCR对筛选的6个基因进行验证,其表达模式与测序结果一致。本研究初步明确了茶饼病侵染对茶树基因转录水平的影响,为揭示茶树抗病的分子机制奠定了基础。