副猪嗜血杆菌vacJ基因缺失菌株构建及其生物学特性分析

为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血杆菌生长、黏附入侵、生物被膜形成及毒力密切相关。     

阴沟肠杆菌乳酸脱氢酶基因缺失突变株的构建及其生物学特性

旨在应用自杀质粒重组技术,构建阴沟肠杆菌乳酸脱氢酶突变株,为进一步提高乙偶姻的产量和扩大菌株选择范围奠定基础.利用双酶切的方法将同源片段插入到自杀质粒pKR6K中,构建出ldh基因敲除质粒,然后利用细菌接合的方法敲除E.cloacae的ldh基因.成功克隆出两段E.cloacae乳酸脱氢酶基因的同源序列,长度分别为52...     

胶胞炭疽菌效应蛋白基因CgE27基因敲除突变株的构建及鉴定

天然橡胶作为重要的工业原料和战略资源,主要来源于巴西橡胶树。橡胶树炭疽病一直是导致其产量难以提高的重要叶部病害之一。效应蛋白作为病原菌侵染植物的重要致病因子,已成为植物与病原菌互作领域的研究热点。为了进一步阐明橡胶树炭疽菌的致病机理,本研究通过RT-PCR技术从橡胶树胶孢炭疽菌中克隆了一个候选效应蛋白基因,命名为CgE27,该基因编码一条121个氨基酸的多肽,分子质量为13.2k D。生物信息学分析表明,CgE27蛋白第1~第22位氨基酸是典型的信号肽序列,不含任何跨膜结构域,暗示该蛋白为分泌蛋白。依据同源重组原理,构建了CgE27基因的敲除载体p CB1532-CgE27,并通过PEG介导转化法将其转入到胶孢炭疽菌原生质体细胞中进行同源交换,经过氯嘧磺隆抗性筛选和分子鉴定,成功获得敲除CgE27基因的胶孢炭疽菌敲除突变体株ΔCgE27,为进一步研究胶孢炭疽菌CgE27基因的功能提供了帮助。     

APEC毒力基因ygeG的原核表达载体构建、表达纯化及鉴定

兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期预测了新的ETT2伴侣分子YgeG,为了获得大量有活性的YgeG蛋白,对其功能进行鉴定,并筛选出与其相关的具有活性的ETT2分泌效应蛋白,将对目的蛋白原核表达条件进行优化。以禽致病性大肠杆菌菌株81(AE81)为模板对基因ygeG进行扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6p-1-ygeG,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,本试验中表达的最佳条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,并且具有良好的免疫原性和反应原性。成功表达了AE81-YgeG蛋白,为该蛋白的结构和功能及ETT2的深入研究奠定基础,为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据。     

东北虎巴氏杆菌毒力基因toxA的克隆及同源性分析

通过对吉林市江南公园送检东北虎病例的病原分离鉴定,分离出多杀性巴氏杆菌,为进一步加强对该病的流行病学调查,并为准确诊断和治疗该病提供依据,实验对该株巴氏杆菌毒力基因toxA进行了研究。根据巴氏杆菌毒力基因toxA序列设计合成1对引物,以临床分离的虎源巴氏杆菌为模板,通过PCR技术,扩增出toxA基因片段。将长约526bp的toxA目的基因克隆到pGEM-T载体上,通过核苷酸序列测定,结果表明toxA基因序列与发表序列（X51512）的同源性为100%。流行病学调查显示,东北虎巴氏杆菌病的病原可能来自其食物（牛、羊肉等）。因此,在饲养过程中应加强检疫,切断巴氏杆菌病食源性传播途径。     

分子伴侣hfq基因缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力及生物被膜生成的影响

为了解非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子伴侣蛋白Hfq在LM毒力中发挥的调控作用,在构建LM-Δhfq缺失株的基础上,通过动物攻毒试验检测野毒株LM-SB5与缺失株LM-Δhfq对昆明系小鼠的LD50,肝、脾载菌量及对肝、脾、肾的病理损伤;通过溶血试验检测二者的溶血活性;通过结晶紫染色的方法检测二者的生物被膜生成能力。以分析hfq基因缺失对LM毒力及生物被膜生成的影响。结果显示,与LM-SB5相比,LM-Δhfq对小鼠的LD50升高了6.067倍,毒力显著降低;肝、脾载菌量在第2,4,5天显著下降(P0.05),在第3天下降极显著(P0.01);对肝、脾、肾的病理损伤也有所减弱,LM-Δhfq较LM-SB5溶血能力下降了2倍,生物被膜生成能力在24 h时显著降低(P0.05)。研究结果证实,Hfq蛋白对LM的毒力及生物被膜生成能力具有重要调控作用。     

黄瓜芽黄突变相关基因ClpP克隆及植物表达载体构建

为了获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,研究其与黄瓜芽黄突变现象的关系,本研究采用TRNzol法提取芽黄突变的黄瓜叶片总RNA,并以其为模板反转录合成cDNA第一链。根据NCBI预测的黄瓜ClpP基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到目的条带后测序,并构建植物表达载体;成功获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,并提交到NCBI。该基因编码区全长495 bp,共编码氨基酸158个。预测其理论等电点为5.22,理论蛋白质分子量为41.00356 KDa,编码的蛋白包含S14_ClpP_2保守结构域,无信号肽。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对发现与毛茛属植物的Clp蛋白酶同源性较高。并成功构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-ClpP。黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列的获得说明该基因在黄瓜中确实存在,这是首次克隆得到了黄瓜中的ClpP基因的cDNA全序列。     

烟草NtTkr尾部T1084缺失和替换突变原核表达载体的构建及诱导表达

已知烟草驱动家族新成员NtTkr尾部第3个卷曲螺旋(Coiled-coil, CC3)第1 084位苏氨酸(T_(1084))对靶蛋白的结合至关重要,通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选得到多个与Ntkr互作的候选蛋白。为确定T_(1084)缺失(T_(1084d))或替换(T1084A)突变对NtTkr与这些候选蛋白体外互作的重要性,首先以pBI121-NtTkr为模板,通过重叠延伸PCR扩增得到烟草NtTkr尾部T_(1084d)、T1084A片段并将其克隆入质粒pUC19,经蓝白斑筛选、SmaⅠ-BamHⅠ双酶切鉴定后送去测序,获得正确的T_(1084)缺失和替换的NtTkr尾部;然后将重组的pUC19-T_(1084d)、pUC19-T1084A与pMXB10进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切,回收目的片段和载体片段并连接,连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选得到重组子,进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切鉴定,最终成功构建pMXB10-NtTkr-T1084A和pMXB10-NtTkr-T_(1084d)原核表达载体;最后将原核表达载体pMXB10-T_(1084d)和pMXB10-T1084A转入BL21(DE3)中,分别经0.05,0.06 mmol/L IPTG浓度诱导,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况,结果证明获得了NtTkr-T_(1084d)-1317和NtTkr-T1084A-1320的成功表达,且IPTG浓度大于0.06 mmol/L时,均可高效表达约77 ku的NtTkr-T1084A-1320和76.2 ku的NtTkr-T_(1084d)-1317蛋白量。     

大肠杆菌生物膜毒力基因的检测

通过确定大肠杆菌形成生物膜毒力基因的分布情况,为大肠杆菌生物膜的形成机理提供理论依据。本实验利用PCR聚合酶链式反应,对25株大肠杆菌阳性菌株菌进行了相关毒力因子fimH,Kp sMTII,chuA,fliC,yja和PapC的检测筛选。其结果显示：KpsMTII在所检测25株菌中出现的频率最高,占40%;其次是fliC,占32.5%,fimH占20%,合计占52.5%;chuA占7.5%,yja和PapC均未检出。结果表明：细菌粘附结构fimH基因和fliC基因是影响大肠杆菌形成生物膜的主要粘附结构毒力基因,其次是大肠杆菌毒力因子KpsMTII基因,最后是外膜蛋白血红素chuA基因。     

水稻突变群体的构建及功能基因组学

随着水稻基因组全序列的测定完成，功能基因组学已成为重点研究内容。功能基因组学主要研究生物有机体内各基因的生物学功能进而了解所有基因如何协调发挥作用完成一系列的生长发育过程。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法，其中最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因功能。本文主要阐述了各种构建方法及其优缺点以及在功能基因分离鉴定上的应用。自发突变的频率极低，且自发突变基因的分离难度比较大，只能作为突变群体构建的辅助方法。利用EMS等化学诱变剂可以在短时间内构建大量点突变群体，并可用TILLING进行突变检测，但多位点的点突变使突变表型难以鉴定。由快中子等物理诱变也可以在短时间内构建大量缺失突变体，且可用Ddeteagene系统进行检测；但多基因缺失、多位点缺失和内含子缺失等使突变表型的分析可能无法进行。利用T—DNA、转座子和反转录转座子等构建插入突变体已经成为突变库构建的主要方法。T—DNA插入已成功应用于水稻大规模突变体的构建，但只限于转基因效率较高的品种；T—DNA在基因组中整合的复杂性以及转基因过程中由组织培养等引发的突变等，增加了突变体表型和分子分析的难度。Tos17是目前应用最为成功的反转录转座子，但多拷贝的插入使突变体的表型鉴定和分子鉴定较为困难，因为只有10％左右的突变性状是由Tos17插入引起的。理论上，Ac／Ds双因子系统是目前最理想的水稻插入突变库构建体系，Ds的单拷贝插入，大大方便了突变体的表型分析和分子鉴定；Ds的回复突变，可以验证突变表型是否由Ds插入引起；但在血转座酶驱动下Ds可能发生的多次跳动所形成的痕迹(footprint)也可能影响突变表型的分析。RNAi可以有效地使目标基因沉默，但并不是所有基因均可被RNAi沉默；对多因一效基因或同源性较高的基因家族，RNAi会同时作用这些基因，沉默表型很难鉴定。可见，每一种方法都有各自的优缺点，但不同的方法是可以互补的，通过各种方法是能够构建成理想的水稻突变库的。     

应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌4型菌株可能毒力基因

为了寻找副猪嗜血杆菌可能毒力基因,采用抑制性差减杂交技术,以HPS有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)为研究对象,构建差减杂交文库,利用Southern Blot分析和PCR鉴定进行差异基因片段的筛选。从构建的文库中共筛选得到7个特异性差异基因片段,经同源性分析,其中5个片段分别与噬菌体重组蛋白、糖基转移酶/荚膜多糖磷酸转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、核糖体蛋白丙氨酸转移酶和ABC型硝酸盐/磺酸盐/碳酸氢盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性;2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关。利用PCR对上述可能与毒力相关的差异基因片段在9种不同血清型HPS中的分布进行了检测,结果表明,7个片段存在于多数的有毒力菌株(血清4,5,12,14,15型)中,而在无毒力菌株(血清3,11型)中均未检测到。利用SSH技术成功构建了HPS有毒力菌株SW124和无毒力菌株H465的差异表达基因差减文库,筛选获得了7个差异基因片段,且上述片段在HPS不同血清型有毒力菌株中分布广泛。     

一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了确定安徽某中华鳖养殖场导致中华鳖发病的病原,为今后生产中有效防控该疾病提供参考.本研究无菌条件下从患病中华鳖体内分离病原,通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析对病原菌进行鉴定;利用回归感染试验对病原菌致病性进行确定,采用琼脂扩散法进行药敏试验,并对病原的毒力基因进行分析.结果从患病中华鳖体内分离纯化得到...     

莱氏野村菌Nr5772菌株对甜菜夜蛾的毒力

旨在确定莱氏野村菌Nr 5772 菌株对甜菜夜蛾的毒力,为甜菜夜蛾的生物防治提供新的技术手段。以甜菜夜蛾幼虫为实验材料,采用浸渍法,测定莱氏野村菌Nr5772 菌株分生孢子对甜菜夜蛾3、4、5龄幼虫的LC50和LT50。结果表明莱氏野村菌5×109个孢子/mL 对甜菜夜蛾3、4、5 龄幼虫的LT50分别为4.44 d、4.48 d 和4.85 d,LC50分别为2.71×106个/mL、5.61×106个/mL 和1.75×107个孢子/mL。莱氏野村菌Nr5772菌株对甜菜夜蛾幼虫有较强的致病力,孢子浓度越高、幼虫龄期越低则致病力越强。     

苏云金芽胞杆菌CY1菌株的cry基因分析

通过醋酸钠-抗生素筛选法从河北省土壤中筛选得到了苏云金芽孢杆菌新菌株CY1。镜检可观察到伴孢晶体呈小菱形。SDS-PAGE分析结果表明菌株CY1表达的晶体蛋白分子量为130 kDa。利用25对通用引物检测cry1,cry1I,cry7,cry2,cry3,cry4/cry10,cry5,cry6,cry7,cry8,cry9,cry11,cry13/14,cry16/17,cry18,cry19,cry21,cry22,cry24/25,cry26/28,cry27/29,cry30,cry32,cry34/35,cry40基因,仅从CY1菌株中检测出cry7基因,该cry7基因N末端的1 215 bp片段所编码的氨基酸序列与已发表的Cry7Ab1(Acc No.:U04367)序列同源性达99%,仅有2个氨基酸的差异。用3对cry7Ab特异引物检测,进一步证实该菌株携带有cry7Ab基因。     

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株杀虫晶体蛋白基因分析

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株是从黑龙江采集的土样中分离获得的新菌株,对其伴孢晶体形状、基因型、蛋白表达以及杀虫活性进行了系统研究.菌株SHJ-5产生的伴孢晶体形状为钝菱形;利用PCR-RFLP技术对该菌株的基因型进行鉴定,结果表明,该菌株含有cry1Aa、cry1Ea、cry1Be、cry1Ah、cry1Ai、cry2...     

我国高效苏芸金杆菌菌株对玉米螟毒力的初步评比

本文以玉米螟为供试昆虫,采用规范化的生物测定方法对全国各地筛选的19个高毒力苏芸金杆菌菌株进行毒力评比.实验结果表明属于血清型H_(3a3b)的各菌株对玉米螟具有较高的毒力.以LD_(50)作为衡量各菌株的毒力指标选出了HD-1、鄂农3号、551和80-1等几个高毒力的菌株,为今后生产高效的苏芸金杆菌制剂提供了依据.     

莱氏野村菌Nr5772菌株对甜菜夜蛾的毒力研究

旨在确定莱氏野村菌Nr 5772菌株对甜菜夜蛾的毒力,为甜菜夜蛾的生物防治提供新的技术手段。以甜菜夜蛾幼虫为实验材料,采用浸渍法,测定莱氏野村菌Nr5772菌株分生孢子对甜菜夜蛾3、4、5龄幼虫的LC50和LT50。结果表明莱氏野村菌5×109个孢子/mL对甜菜夜蛾3、4、5龄幼虫的LT50分别为4.44 d、4.48 d和4.85 d,LC50分别为2.71×106个/mL、5.61×106个/mL和1.75×107个孢子/mL。莱氏野村菌Nr5772菌株对甜菜夜蛾幼虫有较强的致病力,孢子浓度越高、幼虫龄期越低则致病力越强。     

StSRK2E-like基因的序列分析及表达载体构建

SnRK2作为脱落酸(abscisic acid,ABA)信号转导途径的关键因子,对应答非生物胁迫防御机制的形成具有重要作用。为验证马铃薯SnRK2s的功能,本试验以‘青薯9号’为材料,利用RT-PCR对SnRK2家族中的StSRK2E-like基因进行克隆。序列分析显示,该基因CDS序列为1089 bp,编码蛋白全长为362 aa,相对分子质量为41.06 kD,脂溶指数为89.67,亲水指数为-0.321,为亲水性蛋白;进化分析显示该基因与番茄中同源基因的亲缘关系最近,相似性高达98.44%;该基因上游2000 bp启动子序列中除了含有TATA-box和CAAT-box核心元件,还含有干旱相关元件(MBS)及激素响应元件(TCA-element,ABRE,TGA-element),推测该基因参与干旱和激素胁迫应答。用RT-qPCR定量检测不同干旱胁迫时间下马铃薯根、茎和叶中StSRK2E-like基因表达水平。结果显示:StSRK2E-like基因在胁迫处理下的表达量显著低于对照,该结果表示该基因对干旱胁迫敏感;且随胁迫时间增加,对照组茎和叶中StSRK2E-like基因的表达量下调显著,胁迫组叶中下调显著(P<0.05),推测该基因在马铃薯抵御干旱胁迫过程中扮演着重要角色。StSRK2E-like基因的具体功能需要进一步研究。本试验成功构建pJAM1502-StSRK2E-like表达载体,为后续进行StSRK2E-like基因的功能验证提供试验基础。     

我国稻瘟病菌毒力基因的组成及其地理分布

用我国育成的6个近等基因系和IRRI-日本合作育成的24个单基因系,对来自我国吉林、辽宁、河北、江苏、浙江、四川、湖南、福建、广东和云南10个省的322个稻瘟病单孢菌株的毒力基因组成及其地理分布进行了测定和分析.结果表明,我国稻瘟病菌株含有与所有测试抗病基因相应的毒力基因,其中Av-kh+、Av-z+、Av-z5+和Av-9(t)+的出现频     

苹果SLAF图谱构建及果锈基因QTL分析

为了定位苹果果锈的QTL,鉴定果锈基因的遗传位点,以解析苹果果锈基因的分子遗传基础。以宫崎短枝富士×坂田津轻分离群体及其亲本为材料,基于SLAF-seq技术开发分子标签,并构建高密度遗传图谱,结合3个年份的田间表型数据,采用mapqtl进行果锈基因的QTL分析。结果表明,获得了522 122 315 reads(110.32 Gb)的测序数据,测序平均Q30为95.07%,平均GC含量为40.11%;开发了20 440个SLAF标签,7 309 729个SNP;构建了17个连锁群,4 075个上图标记,总图距为2 235.23 cM,平均图距达0.55 cM,上图标记的完整度为99.92%。共检测到了9个果锈相关的QTL,分别分布在Chr3、Chr9、Chr11、Chr15染色体上,标记距离为0～4.9 cM,贡献率为18.0%～85.5%。其中,检测到控制果锈的Qru-9、Qru-15、Qru-3的贡献率较高,可能是控制苹果果锈的关键位点。构建了苹果SLAF遗传图谱,获得了9个与果锈相关的QTL,研究结果对于苹果果锈及其相关基因的进一步挖掘与利用具有重要意义。