马铃薯5种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯S病毒（PVS）的方法。根据 GenBank中PVX、PVM、PVY、PVA及PVS（CP）基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、循环次数、延伸温度、引物组合浓度进行优化,建立了能同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PVX、PVM、PVY、PVA及PVS特异片段,其大小分别是138、213、369、468和657 bp。测序结果表明,5种病毒的序列与相应参考序列相似性达到97%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测植物组织量为10-3 mg。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品和组培苗进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的5种马铃薯病毒。     

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

 根据香蕉束顶病(Banana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病(Cucumber mosaic virus,CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对, 在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上, 建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带, BBTV (748 bp) 和CMV (557 bp) 。扩增产物序列测定结果表明, BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91% ～99% , CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93%～98%。     

葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRa V-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRa V、GLRa V和GFKV以及GFLV和GLRa V。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRa V-2以及引物GLRa V-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRa V-1阳性,3份为GLRa V-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRa V-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRa V-2或GLRa V-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。     

香蕉3种病毒的多重PCR检测体系

根据GenBank中已发表的香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）﹑黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）的基因序列,找出保守序列分别设计出特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测3种病毒的多重PCR检测体系。该体系可同时扩增BBTV的615 bp、CMV的480 bp和BSV的945 bp的特异片段。这些片段克隆测序结果表明,多重PCR扩增的不同病毒片段是特异和专化的,其核苷酸序列与相应的病毒基因片段的相似性都达91%以上。该体系的灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg感病植物组织中均能检测到这3种病毒。     

柑橘碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法建立及应用

柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leafvius,CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之-.本研究在柑橘碎叶病毒-步法RT-PCR检测体系的基础上建立了CTLV的巢式RT-PCR检测方法,并对其检测灵敏度及特异性进行了分析.结果表明,该方法检测灵敏度比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度...     

应应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究

 以采自田间和广东省农业科学院果树研究所防虫隔离网室内嫁接并感染黄龙病的5 个柑橘品种叶片为材料, 以草本指示植物长春花( Catharanthus roseas) 和木本指示植物　柑( Citrus reticulata Blanco) 鉴定为基础, 采用改良的CTAB 法提取总DNA , 在此基础上进行常规PCR 与Nested-PCR 检测, 并对特异目的片段进行克隆、测序。试验证明Nested-PCR 比常规PCR 的灵敏度更高。这两种方法均可以检测出未显症的黄龙病材料, 但Nested-PCR 可以在木本指示植物嫁接后40 d 左右、草本指示植物摩擦接种1 个月左右检测到病原;而常规PCR 在木本植物嫁接后60 d 左右、草本植物摩擦接种近2 个月左右才能检测到病原。常规PCR 所能检测到的最低DNA 的量为pg 数量级; Nested-PCR 检测病原DNA 灵敏度约为常规PCR 的104 倍。     

3种苹果潜隐病毒多重RT-PCR检测体系的建立

 研究建立了能同时检测苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) 和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 的多重RT-PCR方法。以复合感染3种病毒的苹果‘望山红’组培苗为试材, 对影响多重PCR的反应条件进行了一系列的调整和优化。多重RT-PCR体系灵敏性测验显示, 最低能从RNA总量187.5 ng的样品中检测3种病毒的存在。多重RT-PCR产物的序列与报道的病毒序列有较高的同源性, 12个田间苹果样品的多重RT-PCR检测结果与单一PCR的结果一致, 初步证明了多重RT-PCR检测的准确性。     

莲藕中甘薯潜隐病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

甘薯潜隐病毒莲藕分离物(sweet potato latent virus-lotus,SPLV-lotus)在江苏省莲藕产区普遍引起发病,并且该分离物序列与已报道的SPLV甘薯分离物存在较大差异。为进一步监测SPLV-lotus在莲藕上的发生情况,针对SPLV-lotus的CP基因设计并优化特异性引物QSPLV-lotus3-F/QSPLV-lotus3-R,通过优化引物浓度和退火温度条件,构建标准曲线,建立了SPLV-lotus实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测技术。该方法特异性强,可以快速检测出SPLV-lotus,灵敏度为普通PCR的100倍,可广泛应用于脱毒莲藕SPLV-lotus的精确检测。     

柑橘褪绿矮缩病毒dot-ELISA检测方法的建立及应用

【目的】柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)是一种新的柑橘病毒,为给我国柑橘脱毒苗木质量控制和田间监测提供技术支撑,建立了一种灵敏度高、特异性强的快速检测方法。【方法】通过序列分析和相似性比对,明确抗原靶标;构建CCDaV-CP的原核表达载体,诱导目的蛋白表达后作为抗原用于注射兔子,制备抗血清。运用Western blot检测效价。通过优化抗体浓度,建立CCDaV的dot-ELISA检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品检测。【结果】以外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,成功构建了表达载体pET28a-CCDaV-CP,其在18℃,IPTG浓度0.5 mmol·L^-1时,诱导12 h,目的蛋白的表达量高。制备的特异性抗血清效价为1:3000。由此建立的dotELISA检测方法在提取液被稀释640倍时,仍能检测出CCDaV。应用该方法对42份田间疑似样品的检测结果与PCR法的符合率为94.73%。【结论】首次获得了CCDaV的抗血清,并以此建立了快捷、灵敏、准确的dot-ELISA检测方法,...     

应用多重RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒

 根据病毒外壳蛋白基因序列, 设计了2对检测百合无症病毒(LSV) 、百合斑驳病毒(LMoV)的引物, 对扩增条件进行优化, 建立了同时检测LSV和LMoV的多重RT-PCR检测方法。此方法可特异地从带有LSV和LMoV的样品中扩增出2条带LSV (876 bp) 、LMoV (662 bp)。灵敏性测定结果表明, 该双重PCR可从稀释10⁴ 组织中检测出病毒, 具有与单一PCR相同的灵敏性。扩增产物测序表明, LSV扩增产物与其它分离物核苷酸同源性为87.8%～99.3%, LMoV扩增产物与其它分离物的同源性为90.1%～99.5%。     

应用多重RT - PCR检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

 建立了多重RT - PCR同时检测草莓斑驳病毒( SMoV) 和草莓轻型黄边病毒( SMYEV) 的技术体系, 对草莓田间植株和试管苗都可以有效进行检测。多重PCR引物根据引物之间的互补性及引物的Tm值进行筛选。适宜的PCR缓冲液的浓度为2 ×, 退火温度为57℃, 延伸温度为66℃。分别利用单一PCR和多重PCR对微茎尖培养获得的草莓品种宝交早生的11个株系进行了脱毒效果鉴定。     

番茄黄化曲叶病毒的系统发育分析及多重PCR快速检测

通过对国内已报道的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的DNA-A全基因组进行序列比对分析,发现TYLCV各中国分离物具有较高的相似性。TYLCV全序列及CP序列核苷酸和氨基酸系统发育分析结果显示,我国中东部及东南沿海地区为番茄黄化曲叶以色列病毒（TYLCV-IL）各分离物所侵染,而西部和西南部内陆地区为番茄黄化曲叶中国病毒（TYLCCNV）各分离物所侵染。基因多态性分析结果表明,TYLCV在进化上具有较强的保守性,但核苷酸突变位点（Pi）在染色体上的分布却具有较高的多态性,因此针对TYLCV的严格保守区设计出3对特异性引物,建立了以多重PCR技术为基础的快速、高效、特异性检测TYLCV的方法。     

柑橘黄龙病菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

建立基于双重荧光定量PCR检测柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)的方法,并对其准确性进行验证。通过受试者工作特征(ROC)曲线、净重分类改善指数(NRI)和综合判别改善指数(IDI)分析7对CLas实时荧光PCR引物及其联合检测的准确性,评价RNRf/RNRr联合CLas-4G/HLBr的双重实时荧光PCR对CLas的检测价值。ROC曲线分析结果显示,表现最好的引物是RNRf/RNRr,其曲线下面积(AUC)为0.971,高于其他6对引物;其次是CLas-4G/HLBr引物,AUC为0.966;在双引物联合检测中,RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测、CQULA04F/CQULA04R+RNRf/RNRr引物并联检测的相关性能指标较优,AUC分别为0.963和0.966,并且RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测同时具备较高的敏感性(85.19%)和特异性(99.25%)。NRI分析结果表明RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr串联检测的诊断能力相较于LJ900f/LJ900r的单一引...     

柑橘黄化脉明病毒DTBIA检测方法的建立

通过柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）兔源多克隆抗体（一抗）及Ap标记羊抗兔IgG（二抗）最佳稀释度等条件优化建立了CYVCV直接组织点免疫（Direct tissue blot immunoassay,DTBIA）检测方法,并对其特异性、稳定性和检测效果进行了评价。试验结果显示,一抗、二抗稀释比例分别为1︰8 000和1︰2 000时,DTBIA检测CYVCV效果最佳;应用所建立的DTBIA方法对携带9种不同柑橘病害的柑橘样品进行检测时,仅携带CYVCV样品呈阳性反应;柑橘黄脉病样品植物组织印迹后,印迹膜于4 ℃保存,90 d内可进行有效的CYVCV检测;对田间不同柑橘品种利用DTBIA法检测CYVCV,其结果与一步法RT-PCR符合率为97.92%。可见,该CYVCV检测方法快速、简便、稳定、特异及可靠,可推广应用于田间快速检测CYVCV,对于防范柑橘黄化脉明病毒大面积传播流行具有重要的现实意义。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657 bp (CMV) 、428 bp（LMoV）、171 bp (LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV 3种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。     

香蕉束顶病毒实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）复制酶基因保守序列设计特异性探针及引物,建立了BBTV实时荧光PCR（TaqMan real-time PCR）检测方法。结果显示,所建立的检测方法在检测质粒DNA标准品和发病香蕉植株总DNA时,其灵敏度均比普通PCR高,且与黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）无交叉反应。同浓度样品进行7次重复性试验,各重复扩增结果所得Ct值的变异系数为0.93%,表明建立的荧光定量PCR检测方法重复性好,Ct值保持稳定。利用所建立的方法检测带毒香蕉吸芽繁殖的组培苗中的BBTV,发现BBTV含量随着继代数的增加而增加,并且组培苗顶部叶片中的含量高于其他部位的叶片。