菊花ClERF1基因的克隆与表达分析

以甘菊叶片为试验材料,采用RT-PCR和Tail-PCR以及生物信息学的方法,研究了甘菊ClERF1及其启动子序列特征、表达模式,以及甘菊ClERF1在低温胁迫下的响应。以期为进一步研究甘菊ClERF1功能提供参考依据。结果表明:ClERF1基因序列全长1 242 bp,最大开放阅读框(ORF)618 bp,可编码206个氨基酸。经理化性质分析,ClERF1分子量23 631.35 Da,理论等电点5.19,不稳定系数53.84,脂肪指数62.04,平均亲水性-0.786,亚细胞定位在细胞核内。系统进化树表明,ClERF1与拟南芥At3g23240亲缘关系最近,属于ERF亚家族。qRT-PCR分析表明ClERF1在叶片中表达最高,其次在茎段中。该研究克隆了ClERF1启动子序列1 534 bp,主要包括低温反应和乙烯响应元件、生长素和茉莉酸甲酯反应元件等。甘菊低温处理幼苗ClERF1表达量显著高于未低温处理的幼苗,其中5℃时ClERF1相对表达量最高。     

茄子SmNAC1 基因的克隆与表达分析

 以茄子幼苗为试材,利用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得SmNAC1 基因全长,并利 用RT-qPCR 技术检测该基因在GA、4 ℃低温、NaCl 处理下的时空表达。结果显示：SmNAC1 全长序列 1 279 bp,开放阅读框为909 bp,编码302 个氨基酸,推测其蛋白质分子量约35.04 kD;SmNAC1 含有 NAC 家族的N 端保守域,与番茄、马铃薯同源性高达90%。SmNAC1 受GA、低温和高盐诱导,表达上 调,但在根、茎、叶中的表达量有差异,在根中表达水平整体高于茎和叶中,显示SmNAC1 在根中优势 表达,且短时间（0.5 ~ 1 h）相对表达量较高,而在茎和叶中应答相对迟缓,且叶中表达水平趋于稳定。 可见SmNAC1 可能参与了茄子对外源GA 诱导的响应及对低温、高盐胁迫的耐受调节过程。     

甜瓜CmGnT基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为了探究非生物胁迫下甜瓜N–乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的作用机制,根据甜瓜cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆得到CmGnT。生物信息学分析表明,CmGnT的cDNA全长为2 193 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸。CmGnT蛋白分子量约为46 kD,理论等电点(pI)为7.93。蛋白结构分析表明,CmGnT含有β–1,4–N–乙酰氨基葡萄糖转移酶结构域,属于糖基转移酶17家族。该基因编码的蛋白有1个强的跨膜螺旋结构。进化树分析表明,CmGnT氨基酸序列与黄瓜CsGnT(登录号:XP_004135275.1)亲缘关系最近,同源性为99.74%,与西瓜Cs Gn T的同源性为97.70%。实时荧光定量PCR分析结果表明,在NaCl、PEG、H_2O_2和ABA等非生物胁迫下的甜瓜叶片中CmGnT都显著上调表达,表明CmGnT受非生物胁迫诱导,推测其在甜瓜响09应非生物胁迫过程中起到重要作用。     

甜瓜花器官发育相关基因的电子克隆及表达分析

以厚皮甜瓜（Cucumis melo）‘WI998’（纯雌系）与‘TopMark’（雄全同株）配制杂交组合获得的RIL₆群体为材料,对分离后代雌雄异花同株,雄全同株,完全花植株及纯雌株进行转录组测序,利用生物信息学分析方法,获得花器官发育相关基因序列Un16008,命名为CmTs2。该序列位于甜瓜第12条染色体上,长度1 842 bp,119 ~ 832之间存在一个包含237个氨基酸的最大开放式阅读框,成熟蛋白分子量为25 358.8 D,该蛋白不稳定系数为21.6,脂肪系数是99.11,平均亲水系数为0.078。通过Blast比对发现该基因与多种作物Tasselseeds2（TS2）基因具有高度同源性,其中与黄瓜Tasselseeds2基因同源性高达96%。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在甜瓜雌雄异花同株花和叶片中表达量均高于其它性别类型植株,在纯雌株中表达量最低,说明该基因可能参与甜瓜花器官发育,尤其是雌花发育的过程。     

甜瓜自毒胁迫响应基因CmFe-SOD的克隆及表达分析

【目的】克隆根系分泌物介导的甜瓜自毒胁迫响应基因Fe-SOD,分析基因序列特征和表达情况,探讨其功能。【方法】以甜瓜幼苗为材料,通过RT-PCR技术克隆Fe-SOD基因,命名为CmFe-SOD,进行生物信息学分析和亚细胞定位;通过qRT-PCR技术分析CmFe-SOD在自毒胁迫后甜瓜幼苗叶片和根系中的表达模式。【结果】CmFe-SOD基因组DNA全长1 255 bp,开放阅读框918 bp,编码305个氨基酸。生物信息学分析显示CmFe-SOD为酸性亲水蛋白,无信号肽和跨膜区域,二级结构中无规则卷曲比例最高,与三级结构预测结果一致,基因序列包含典型的Fe-SOD蛋白结构域。同源性分析表明,不同来源Fe-SOD在氨基酸序列上具有较高同源性,CmFe-SOD蛋白与黄瓜的关系较近。通过洋葱内表皮GFP荧光定位观察发现,CmFe-SOD定位于细胞质;qRT-PCR结果显示,根系分泌物处理后甜瓜幼苗叶片中CmFe-SOD基因表达水平整体呈增加趋势,在24 h时表达量最高;在根系中呈现先增加后下降趋势,6 h时表达量最高。【结论】CmFe-SOD基因在进化上较保守,参与了甜瓜根系分泌物介导的自毒胁迫响应,自毒胁迫后在叶片中表达量呈持续上升的趋势,在根部呈现先上升后下降的趋势。     

甘蓝BYPASS1 编码基因的克隆与表达分析

通过双向电泳结合MALDI-TOF-TOF/MS 质谱技术在甘蓝柱头内鉴定出1 个受自花授粉诱导
上调表达的BYPASS1 蛋白（BPS1）。利用PCR 技术扩增甘蓝BPS1 基因的编码序列, 序列分析结果表明：
该基因没有内含子,开放阅读框为1 059 bp,编码352 个氨基酸,蛋白质分子量为38.7 kD。氨基酸同源
性和系统发生树分析结果表明：甘蓝BPS1 与拟南芥BPS1 亲缘最近,氨基酸同源相似性达85%;与烟草
BPS2 关系较远。RT-PCR 检测结果表明：甘蓝BPS1 基因在开花前1～2 d 的花瓣、萼片、花药、柱头和
叶片中均有表达,柱头中的表达量最高。实时荧光 定量PCR 分析结果表明：甘蓝柱头内BPS1 表达水平在
自花授粉后逐渐升高,异花授粉后柱头内BPS1 表达水平先升高后降低再升高。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHY1的克隆与表达分析

 根据植物C3HC4型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物, 通过RT2PCR结合RACE 方法从菠萝(Ananas comosus L. Merr) 幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长, 将其命名为AcRCHY1。该基因cDNA全长1 261 bp, 开放阅读框ORF为918 bp, 推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽。AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4 (RING finger) 和CHY两个锌指结构域, 与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%～91%。半定量RT-PCR分析表明, AcRCHY1 在菠萝中呈组成性表达, 在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶; 低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后, AcRCHY1在叶片中的表达明显增强。因此, AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关, 而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径。     

薄皮甜瓜白啄瓜枯萎病抗性基因Fom-2的同源克隆与表达分析

枯萎病是甜瓜等瓜类作物的毁灭性病害,Fom-2基因介导了甜瓜抗枯萎病生理小种0和1,抗枯萎病育种是甜瓜等瓜类作物育种的重要目标之一。通过同源克隆方法从薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2,推定编码1099个氨基酸,所推定的蛋白质序列经Blast分析与数据库中NBS-LRR类R基因具有较高的同源性。进一步序列...     

卷丹LlAGO1基因的克隆及表达分析

以卷丹（Lilium lancifolium）叶腋组织为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到AGO1基因的cDNA全长,命名为LlAGO1。其全长4 014 bp,开放阅读框长3 687 bp,编码1 228个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为135.36 kD,理论等电点（pI）为9.57。氨基酸序列分析表明LlAGO1含有PAZ和Piwi两个AGO1典型的结构域;信号肽预测结果表明LlAGO1蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白;亚细胞定位预测其主要定位于细胞核;与相关同源蛋白高度相似,且与芦笋AGO1a蛋白（XP_020260210.1）亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明：LlAGO1在卷丹叶腋、鳞片、根、叶等不同组织均有表达,其中在叶腋中的表达量最高,叶片和根中的表达较弱;腋生珠芽形成过程中,LlAGO1仅在可形成珠芽的上部叶腋表达,且在珠芽形成时表达量最高,而在不形成珠芽的下部叶腋几乎不表达,推测LlAGO1可能与卷丹珠芽的形成相关。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

据《园艺学报》2014年第2期《草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析》（作者张勇等）报道，以“丰香”草莓为试材进行基因克隆，并通过SON—PCR结合RT—PCR技术检测了该基因在低温胁迫和其他环境胁迫下的诱导表达特性。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

草莓FaCOP1的克隆及其表达特异性分析

为探索草莓光形态建成抑制子FaCOP1的功能及其表达特异性,采用同源克隆法获得‘丰香’草莓FaCOP1的完整开放阅读框序列,对该序列及其编码的氨基酸序列进行相关生物信息学分析,同时采用qRT-PCR分析该基因的时空表达以及在不同光质处理下的表达模式。结果表明,FaCOP1开放阅读框全长1 989 bp,Gen Bank登录号为KX583676,编码662个氨基酸,蛋白质分子量为74.7187 kD,理论等电点为6.54,具有环形锌指域,卷曲螺旋域和WD40重复序列等3个保守结构域。序列比对以及系统进化树分析发现,COP1进化过程中具有高度保守性以及物种间的差异性。qRT-PCR结果表明,FaCOP1在草莓的根、茎、叶、花及成熟果实中均有表达,花中的表达量最高,其次是叶和根,而茎和成熟果实中最少。随着草莓果实的发育(从小绿期到全红期)FaCOP1的转录水平总体呈现递减的规律,与果实花青素积累模式相反。草莓叶片和果实的FaCOP1表达均能够被白、红、蓝及红蓝光(1︰1)诱导。FaCOP1在转录水平上没有阻遏FaHY5的表达,其关系需在蛋白质水平上进一步验证。     

甜瓜抗旱性相关基因MeP5CS的克隆、序列分析及表达

用GenBank登录的抗旱相关基因序列进行比对,在保守区域设计一对引物,利用RT-PCR获得了一个甜瓜抗旱相关基因,命名为MeP5CS。生物信息学分析表明,该基因全长1000bp,开放阅读框(ORF)753bp,编码250个氨基酸;MeP5CS蛋白大小约82.18kD,理论pI值为4.90;MeP5CS编码蛋白与桐花树、猕猴桃和葡萄同源性较高,分别为94%、81%和73%。该蛋白含约40.2%的α-螺旋,25.2%的β-转角,34.6%的不规则卷曲,在第19～20氨基酸之间存在信号肽的剪切位点;MeP5CS编码蛋白是疏水性蛋白,有2个跨膜螺旋结构和13个磷酸化位点。半定量RT-PCR表明,MeP5CS在甜瓜根系中表达最高,茎中次之,叶片中表达较低。MeP5CS基因在甜瓜组织中的表达受丛枝菌根真菌(AMF)和水分胁迫双重诱导,与甜瓜的组织特异性和水分胁迫处理时间有关。水分胁迫条件下,接种AMF可以显著增加甜瓜幼苗脯氨酸的积累量,菌根甜瓜幼苗的脯氨酸积累与MeP5CS基因的表达呈正相关。     

甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物, 采用RT-PCR方法从甜瓜花后25 d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段, 克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明, 该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9% , GenBank中登记号为DQ355797。通过Northern blot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化, 结果表明该基因在甜瓜果实花后25 d开始表达,随着果实的成熟, 表达量升高。     

唐菖蒲茉莉素受体基因GhCOI1的克隆与表达分析

通过RACE技术在唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种‘Rose Supreme’的籽球苗叶片中克隆得到茉莉素受体COI1基因的c DNA序列,命名为Gh COI1。该基因全长为2 603 bp,包含一个编码613个氨基酸的开放阅读框,5′utr和3′utr分别为484 bp和277 bp,预测的蛋白质分子量为69.46 k D;其氨基酸序列具有典型的F-box基序和LRRs结构域。同源比对和系统进化树的分析结果表明,Gh COI1与番茄Le COI1氨基酸序列的相似性最高,达到64.3%;与水稻Os COI1的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR分析基因表达的结果表明,Gh COI1在唐菖蒲叶片中的相对表达量最高,根中其次,匍匐茎、新球、籽球、花瓣、雄蕊、雌蕊里中的相对表达量较低,推测在唐菖蒲中存在器官专一性表达的COI1同源基因。采用0.05、0.1和0.5 mmol·L-1 Me JA喷施处理唐菖蒲叶片,检测到施用0.1 mmol·L-1 Me JA可显著上调Gh COI1的表达。同时伴随此浓度Me JA处理时间的增加,12 h内Gh COI1的表达量呈现先上升再下降后上升的趋势。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明Gh COI1蛋白定位于细胞质和质体中。本研究中初步验证了Gh COI1在茉莉素信号途径中的作用。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

甜瓜中甜菜碱醛脱氢酶基因CmBADH的克隆及非生物胁迫下的表达分析

 以甜瓜（Cucumis melo L.）‘TS-2’为材料,根据GenBank 登录的植物甜菜碱醛脱氢酶氨基 酸保守序列设计兼并引物,利用RT-PCR 和3′、5′RACE 技术从甜瓜叶片中克隆到1 个甜菜碱醛脱氢酶基 因,命名为CmBADH,在GenBank 中的注册号为：JN091961.1。生物信息学分析表明,该基因全长1 856 bp, 编码503 个氨基酸,BADH 蛋白大小约54 kD,理论pI 为5.182。甜瓜BADH 蛋白与麻疯树同源性最高, 为82.96%。该基因编码蛋白有4 个强的跨膜螺旋结构。PlantCare 分析结果显示该基因序列具有茉莉酸甲 酯、防御与胁迫、玉米醇蛋白代谢途径、低温、光响应、分生组织表达、生理周期调控等顺式作用元件 和干旱诱导的MYB 结合位点。实时荧光定量PCR 表明,CmBADH 受盐、干旱、低温、高温诱导,其表 达均呈现先上升后下降的趋势;CmBADH 还随外源ABA 诱导时间的延长呈现上升表达的趋势。     

苹果MxIrt1基因的克隆与原核表达

根据植物IRT(Iron Regulated Transporter)家族的功能保守区设计引物,通过RACE法从缺铁胁迫处理的小金海棠根系cDNA文库中克隆得到了Fe²⁺转运蛋白基因cDNA全长,将其命名为MxIrt1(Malus xiaojinensis Iron regulated transporter 1)。将MxIrt1 cDNA片段与pET30a构建原核表达载体pEIrt,转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol·L^-1 IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个40kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了试验基础。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。