真鲷虹彩病毒引起养殖斑石鲷大规模死亡的研究

2017年8月,山东省烟台市某养殖场网箱养殖的斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼突然发病并大量急性死亡。疾病调查显示,养殖海域水温为26℃~28℃;病鱼为4~5月龄,全长为(16.3± 1.6) cm,体重为(156.9±37.0) g;80万尾斑石鲷幼鱼2周内累积死亡率达90%以上,经济损失惨重。临诊检查发现,病鱼体表无明显损伤,但活力差、呼吸急促。剖检可见病鱼脾肿大、质地脆、易碎,肾糜烂,肝有出血点。组织切片观察发现,病鱼脾、肾造血组织中可见许多直径约为20 μm的肿大细胞,肿大细胞内含有大量直径约为145 nm、呈六边形的病毒颗粒。用过滤除菌的病鱼脾组织匀浆液,腹腔注射感染健康斑石鲷,感染组14 d内累积死亡率达95%。人工感染病鱼表现出与自然发病鱼类似的外观症状,且在脾、肾组织切片中也可观察到大量的肿大细胞及相似的病毒粒子。使用特异性PCR引物,从自然发病鱼和人工感染病鱼的肝、脾和肾组织中均检测到鱼类虹彩病毒的高强度感染。克隆、测序得到了1362 bp的病毒主要衣壳蛋白基因(MCP),序列比对显示,该病毒的MCP序列与真鲷虹彩病毒(RSIV) RIE12-1的相应序列完全相同。构建的虹彩病毒系统发育树也显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群,是RSIV的一个分离株。本研究首次证实RSIV可以导致斑石鲷大规模死亡,研究结果为诊断和防治斑石鲷病毒病提供了重要参考。     

斑石鲷irf7基因克隆及其在病毒感染下的表达

为探究斑石鲷(Oplegnathus punctatus)干扰素调节因子irf7在虹彩病毒(Iridovirus)感染过程中的作用机制,本研究通过PCR扩增获得了斑石鲷irf7基因CDS区序列,对其序列特征进行分析,并在组织水平和细胞水平研究该基因在病毒感染中的表达模式。结果显示,Opirf7基因CDS区全长为1332 bp,编码443个氨基酸的多肽,具有干扰素调节因子家族的保守结构域。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,Opirf7基因在健康个体的不同组织中均有表达,在肝脏中表达量最高,在皮肤和肠等免疫组织中的表达量也较高。对斑石鲷腹腔注射虹彩病毒诱导抗病毒免疫反应,在组织水平检测Opirf7对病毒感染的响应模式。与对照组(0 h)相比,Opirf7在免疫组织中的表达水平有不同程度的升高。在细胞水平,建立poly I: C感染的斑石鲷脑细胞系模型,利用qRT-PCR检测Opirf7的表达变化。结果显示,poly I: C刺激后,脑细胞系Opirf7的表达量显著升高。结果表明,Opirf7在斑石鲷抗病毒病的免疫应答过程中发挥重要作用。     

斑石鲷和条石鲷线粒体基因组密码子使用分析

为研究石鲷科中斑石鲷和条石鲷线粒体基因编码序列密码子的使用模式和特性,进而探讨这2种鱼与其他水生动物的亲缘关系,以期为探讨2种鱼类间的近缘杂交育种、种质资源等研究提供理论依据。在美国国立生物技术信息中心GenBank数据库中搜索并下载斑石鲷、条石鲷、斑马鱼、金鼓鱼、黑鲷和真鲷6种鱼线粒体基因序列,以CodonW、SPSS等软件采用生物信息学方法对斑石鲷和条石鲷线粒体DNA编码蛋白质的基因序列进行分析,通过相对密码子使用度以及对密码子的偏好性和基因序列进行相关性和聚类分析,进而探讨其亲缘关系。研究结果表明,斑石鲷和条石鲷线粒体DNA编码蛋白质的基因偏爱使用AC结尾的密码子,UUC、ACC等密码子为斑石鲷和条石鲷线粒体DNA编码蛋白质基因的偏好性密码子。在基因序列及偏好密码子聚类中,斑石鲷与条石鲷、黑鲷与真鲷均首先聚为一类,亲缘关系最近,这与传统分类学一致;斑石鲷和条石鲷与斑马鱼的遗传距离最远,亲缘关系最远。     

斑石鲷最适蛋白需求量的研究

以鱼粉为蛋白源,配制5个不同蛋白水平的等能饲料,饲养斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼8周,分析斑石鲷最适蛋白需求量。结果表明,饲料蛋白水平对斑石鲷终末体重、增重率、特定生长率和蛋白效率均具有显著影响(P0.05)。蛋白水平36.85%时,终末体重、增重率、特定生长率和蛋白效率均达到最大值,且显著高于其它各试验组(P0.05)。除蛋白效率在蛋白水平升高至50.38%时,降低至与蛋白水平36.85%组相当,二组之间差异不显著(P0.05)外,其余各指标均随蛋白水平的升高而下降,但仍显著高于30.83%蛋白水平组(P0.05)。在本试验研究条件下,通过对特定生长率和饲料蛋白水平的抛物线和直线回归分析,满足斑石鲷最大特定生长率所需蛋白水平为37.77%~40.07%。     

船载振动胁迫对斑石鲷影响实验研究

为了探索鱼类在船载振动条件下的应激响应和适应性,为深远海大型养殖平台养殖工艺设计与模式构建提供基础数据和理论依据,利用机械振动台模拟船载工况,研究不同振动频率和时间条件下斑石鲷(Oplegnathus punctatus)的血液和生化指标变化情况。结果表明:振动时间5 min,10 Hz组和50 Hz组的斑石鲷各方面指标均与对照组无显著性差异,30 Hz组的血清葡萄糖显著降低,皮质醇和肾上腺素指标显著升高,肌糖原和肝糖原无显著差异;振动时间60 min,各实验组斑石鲷的血清葡萄糖指标均显著降低,皮质醇和肾上腺素指标显著升高,但对肌糖原和肝糖原指标无显著影响;水质变化情况显示,振动60 min后水体内溶氧浓度和氨氮浓度指标有所上升,水温、盐度、p H等无明显变化。研究表明,低频振动对鱼类的影响主要是通过产生水流变化进而被侧线器官感受到,引起斑石鲷脑神经兴奋,产生应激。短时振动对斑石鲷不会造成较大影响,而长时间振动会引起斑石鲷一定程度的应激反应。     

斑石鲷陆海接力养殖初步研究

为验证斑石鲷陆海接力养殖模式的可行性,将工厂化循环水培育的大规格斑石鲷(350.6±24.3) g,转运投放至莱州湾开放海域大型工程化围栏,开展陆海接力养殖试验,并与同期工厂化循环水养殖斑石鲷进行了为期120 d的对比试验,统计分析斑石鲷的生长特性、血清非特异性免疫指标和抗氧化酶活性以及养殖经济效益。结果显示：经120 d的工厂化循环水养殖后,斑石鲷的平均体质量增长至(547.6±25.2) g,存活率为95.8%;陆海接力养殖的斑石鲷平均体质量增长至(735.7±27.9) g,存活率为98.3%,平均体质量和存活率比工厂化循环水养殖分别高34.3%和2.6%。经过陆海接力养殖的斑石鲷其血清溶菌酶(LZS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性都显著高于工厂化循环水养殖(P<0.05),分别提高了40.5%、43.2%、42.3%和39.8%。此外,陆海接力养殖的净利润比工厂化循环水养殖高38.37%。综上,大规格斑石鲷经过大型工程化围栏陆海接力养殖生长性状、免疫力、抗氧化状态和经济效益都得到了提高,本研究结果可为斑石鲷陆海接...     

真鲷虹彩病毒引起养殖斑石鲷大规模死亡的研究

干扰素调节因子 (irf3)是干扰素调节因子 (IRF)家族的一员,是I型干扰素依赖性免疫反应的主要转录调节因子,在针对DNA和RNA病毒的先天免疫反应中发挥重要作用。本研究中,斑石鲷irf3基因 (Oplegnathus punctatus interferon regulatory factors 3,Opirf3)来自实验室斑石鲷基因组数据库,经分析鉴定Opirf3的CDS序列全长1 362 bp,可编码453个氨基酸,预测其蛋白分子量为50.0 ku,理论等电点为4.97,有一个IRF结构域和一个IRF-3结构域。荧光定量分析结果显示,Opirf3在斑石鲷肝脏、鳃、心脏、皮肤、脾脏、肠、脑、肾脏、胃和头肾组织均有表达;虹彩病毒感染7 d时,免疫组织肝脏、脾脏和肾脏中Opirf3的表达水平显著上调。斑石鲷肾细胞系体外刺激实验显示,不同浓度poly I:C刺激后,Opirf3的表达量较对照组均显著升高,poly I:C浓度为100 μg/mL时,肾脏细胞中Opirf3的相对表达水平升高,为对照组的86.8倍。siRNA干扰后,斑石鲷肾细胞系中Opirf3表达水平显著下调30%,下游基因IFN-α、CD40、CD80和IL-1β显著下调,IL-6显著上调。以上结果可能表明Opirf3基因参与了I型IFN在斑石鲷抗虹彩病毒过程中的先天免疫反应。本研究可为斑石鲷抗病分子育种提供理论依据。

     

斑石鲷的引进养殖试验

为探索斑石鲷(Oplegnathus punctatus)养殖技术,引进斑石鲷(体长6 cm、体质量约6 g)进行室内水泥池的幼鱼培育和海区网箱养殖,经过六个月的养殖试验,结果表明:经125 d的室内水泥池幼鱼培育,斑石鲷幼鱼平均体质量达120.3 g/尾,日增重0.91 g;移至海区网箱养殖61 d后平均规格达243...     

斑石鲷肾脏细胞系的建立、特征分析及其免疫相关基因的表达分析

斑石鲷(Oplegnathus punctatus)是我国重要的海水养殖鱼类, 本研究以斑石鲷肾脏组织为材料, 建立了斑石鲷肾脏组织细胞系(O. punctatus kidney cell line, OPK)。斑石鲷肾脏细胞系生长旺盛, 目前已成功传至 34 代。本研究检测了不同 FBS 浓度对斑石鲷肾脏细胞生长的影响, 结果表明最适生长 FBS 浓度为 20%。将 OPK 细胞液氮冷冻复苏后, 细胞具有活性, 可正常生长和传代。核型分析结果显示, 第 24 代斑石鲷肾脏细胞系核型为正常二倍体核型(2n=2sm+46t)。将 Cy3-siRNA 转染到 OPK 细胞后, 可以成功表达荧光。对斑石鲷 OPK 细胞提取 DNA, 用斑石鲷线粒体色素细胞 C 氧化酶 I (CO I)基因进行检测, 结果表明该细胞系来源于斑石鲷。斑石鲷肾脏细胞系细胞在受到脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(poly I∶C)刺激后能产生免疫反应, 免疫相关基因 IκB、IL-1β、IL-8 和 IRF3 的表达水平发生显著变化。本研究成功建立了斑石鲷肾脏细胞系, 可运用于斑石鲷基因功能分析、细胞遗传学、致病性细菌和病毒感染机制等研究, 可为斑石鲷的基础研究和细胞工程育种等提供重要的基础材料。     

斑石鲷irf3基因鉴定及其在虹彩病毒感染下的表达模式分析

干扰素调节因子（irf3）是干扰素调节因子（IRF）家族的一员,是I型干扰素依赖性免疫反应的主要转录调节因子,在针对DNA和RNA病毒的先天免疫反应中发挥重要作用。本研究中,斑石鲷irf3基因（Oplegnathus punctatus interferon regulatory factors 3,Opirf3）来自实验室斑石鲷基因组数据库,经分析鉴定Opirf3的CDS序列全长1362 bp,可编码453个氨基酸,预测其蛋白分子量为50.0 kDa,理论等电点为4.97,有一个IRF结构域和一个IRF-3结构域。荧光定量分析显示,Opirf3在斑石鲷肝脏、鳃、心脏、皮肤、脾脏、肠、脑、肾、胃和头肾组织均有表达;虹彩病毒感染7 d时,免疫组织肝、脾和肾脏中Opirf3的表达水平显著上调。斑石鲷肾细胞系体外刺激实验显示,不同浓度poly I:C刺激后,Opirf3的表达量较对照组均显著升高,poly I:C浓度为100 μg/mL时,肾细胞中Opirf3的相对表达水平升高,为对照组的86.8倍。siRNA干扰后,斑石鲷肾细胞系中Opirf3表达水平显著下调30%,下游基因IFN-α、CD40、CD80和IL-1β显著下调,IL-6显著上调。以上结果可能表明Opirf3基因参与了I型IFN在斑石鲷抗虹彩病毒过程中的先天免疫反应。本研究可为斑石鲷抗病分子育种提供理论依据。     

南方地区斑石鲷养殖技术要点

<正>斑石鲷(Oplegnathus punctatus),俗称斑鲷、花金鼓、黑金鼓,属鲈形目、石鲷科、石鲷属鱼类(图1),自然资源稀少,无明显的盛渔期。分布于朝鲜、日本、台湾岛以及中国南海、东海、黄海等海域,属温、热带近海沿岸中下层鱼类,喜栖息于岩礁或珊瑚礁海域。斑石鲷不仅体态优美,而且肉质鲜美,营养价值和药用价值极高,是一种具有养殖前景的优良经济鱼类。2014年山东莱州明波水产有限公司成功培育出斑石鲷人工鱼苗,为国     

4月龄斑石鲷生长性状的相关分析与通径分析

为揭示影响4月龄斑石鲷体质量的形态性状及其影响程度和生长规律特征,采用相关分析、通径分析、主成分分析等方法对随机选取的100尾4月龄斑石鲷的体质量(Y)和全长、尾鳍长、头长、尾长、吻长、眼径、体高、尾柄高、体长、躯干长等10个形态学指标(X1~X10)进行分析。结果表明:4月龄斑石鲷各形态性状指标与体质量的相关系数为0.357~0.943,且均达到极显著水平(P<0.01);通径分析表明,体长、体高和尾柄高是影响4月龄斑石鲷体质量的主要自变量,体长通径系数最大(0.518),尾柄高通径系数最小(0.124);所选性状与体质量的R2=0.930,大于0.850,表明自变量的主成分已经找到,通过逐步回归分析及偏回归系数的显著检验,建立了体长(X9)、体高(X7)和尾柄高(X8)对4月龄斑石鲷体质量的回归方程Y=3.614X9+3.983X7+6.025X8-32.817;主成分分析中第一主成分贡献率为66.019%,累计贡献率为76.025%,反映了全长、体长、体质量、体高方面的信息,主要指向不同部位的发育状况。综合分析结果,建议将体长作为4月龄斑石鲷选育的目标性状。     

生物素对斑石鲷生长与血清生化指标的影响

采用单因子实验设计方法,进行了饲料中添加生物素对斑石鲷生长和血清生化指标影响的研究,设计了6个不同生物素水平(0、0.01、0.05、0.25、1.25和6.25 mg/kg)的等氮等能饲料,投喂初始体重为(150.16±0.07)g的斑石鲷(Oplegnathus punctatus)10周。结果表明:随着饲料中生物素含量的增加,斑石鲷增重率和特定生长率显著提高,0.25mg/kg添加组生长性能最佳;0.01、0.05mg/kg添加组,总蛋白、白蛋白和球蛋白含量最高,组间差异不显著(P0.05);0.25mg/kg添加组甘油三酯含量最高;1.25mg/kg添加组总胆固醇含量最高;0.05mg/kg添加组血清超氧化物歧化酶活性最强。生长性能与血清各生化指标值均在0.00mg/kg添加组最小。可见,饲料中添加生物素可以显著提高斑石鲷的生长和血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性。缺乏生物素,可导致斑石鲷体色变淡,摄食积极性下降;添加量不得当可威胁鱼体健康生长与营养价值。     

斑石鲷低氧耐受能力及血液生理生化指标变化研究

为阐明斑石鲷(Oplegnathus punctatus)低氧耐受能力及低氧胁迫过程中血液生理生化指标的变化规律,本研究通过生理学和生态学方法,查明2种规格斑石鲷在临界氧分压(critical oxygen tension, Pcrit)和失去平衡点(loss equilibrium, LOE)时的溶解氧浓度,观察自然耗氧条件下其呼吸行为变化,分析低氧胁迫和恢复溶解氧过程中血液皮质醇和葡萄糖含量、血红蛋白(hemoglobin, Hb)浓度、红细胞(red blood cell, RBC)和白细胞(white blood cell, WBC)数目、红细胞积压(hematocrit, HCT)变化。结果显示,在水温(23.0±0.5)℃、氨氮浓度<0.5 mg/L、亚硝酸盐浓度0~0.05 mg/L、盐度为30、pH为7.80的条件下,200和50 g斑石鲷的Pcrit值分别为(4.05±0.09)和(3.15±0.12) mg/L,LOE值分别为(1.16±0.08)和(0.93±0.11) mg/L,且50 g斑石鲷到达LOE值的时间(t=480 min)比200 g斑石鲷(t=110 min)更长;自然耗氧过程中,2种规格斑石鲷呼吸频率均呈先升高后降低的变化趋势,且均在Pcrit值处显著升高,达到最大值(P<0.05)。低氧胁迫导致血浆葡萄糖和皮质醇含量显著升高,在LOE值处达到最大值(P<0.05),但50 g斑石鲷的葡萄糖和皮质醇含量上升幅度显著低于200 g斑石鲷(P<0.05)。同时,低氧引起斑石鲷的WBC和RBC数目、Hb浓度和HCT显著升高,50和200 g斑石鲷分别在Pcrit和LOE值处达到最大值(P<0.05)。恢复正常溶解氧24 h后,2种规格斑石鲷均恢复正常呼吸运动,上述生理生化指标均与对照组无显著差异(P>0.05)。综上所述,2种规格的斑石鲷相比较,50 g斑石鲷的低氧耐受能力更强,200 g斑石鲷对低氧胁迫的应激反应更敏感,2种规格斑石鲷均可通过增加呼吸频率、提高血液WBC和RBC数、皮质醇、葡萄糖和Hb浓度,增强对溶解氧的吸收利用,应对低氧胁迫导致的生理状态改变,相关结果为斑石鲷高效养殖提供了基础数据。     

不同健康程度和抗生素氟苯尼考干预下斑石鲷肠道菌群的结构差异

为了研究不同健康程度和抗生素氟苯尼考干预下斑石鲷肠道菌群结构的差异及其与养殖环境中菌群结构的相关性,采用Illumina Hi Seq PE250高通量测序的方法对健康、亚健康、典型黑身病和口服氟苯尼考条件下的斑石鲷肠道、养殖水体和颗粒饵料中的细菌多样性及群落结构进行了分析比较。结果显示,养殖水体中细菌多样性高于肠道和颗粒饵料。不同健康程度及氟苯尼考干预下斑石鲷肠道中细菌均以变形菌门、厚壁菌门和软壁菌门为主,且对应的操作分类单元(OTU)占样品全部OTU的比例均达到85%以上。黑身病的发生可影响斑石鲷肠道中丰度最高的前20种优势细菌种类的排名次序,其中变形菌门中的弧菌属的相对丰度显著增加,且随着弧菌属丰度的增加,斑石鲷的黑身病症状也逐渐加重。饵料中添加氟苯尼考投喂斑石鲷能使患病鱼肠道弧菌属的丰度从60.33%下降到1.29%,较大程度改变了肠道的菌群结构,并证实氟苯尼考有效防治黑身病。其次,养殖水体和颗粒饵料对斑石鲷肠道菌群也有一定影响,且养殖水体的影响高于颗粒饵料。本研究首次报道了斑石鲷肠道菌群结构,其研究结果为今后斑石鲷的健康养殖、疾病防控及其微生态学研究提供了参考依据和技术支撑。     

中国养殖斑石鲷(Oplegnathus puncatus)上皮囊肿病的发现及显微观察

2015年,山东省某养殖场工厂化养殖的斑石鲷(Oplegnathus puncatus)幼鱼(全长为15 cm左右)因病陆续死亡,15d内累积死亡率达40％以上.现场调查发现,发病池水温为21℃,盐度为30.患病鱼群散开、不聚集.病鱼身体侧偏,活力差,常贴底或者贴壁,严重者随着水流漂流.病鱼呼吸困难,口部持续张开,鳃盖开合频繁,对投喂的食物无反应.但病鱼反应灵敏,难以捕捉.临床检查和剖检可见病鱼鳃表面覆盖着大量黏液,鳃丝有损伤,肠道无食物.取病鱼鳃丝制成水浸片,在光学显微镜下观察,鳃丝上可见到许多直径约为30-70 μm的囊肿物,外观圆形或卵圆形,呈浅黄棕色.在苏木精-伊红染色的石蜡切片中,病鱼次级鳃丝末端粘连,许多上皮细胞膨大呈囊肿状.囊肿嗜碱性,内部均质化.在扫描电子显微镜下观察,病鱼鳃丝呈棍棒化,鳃小片被大量黏液覆盖,表面光滑的囊肿细胞镶嵌其间.通过上述疾病现场调查、病鱼的临床检查、鳃组织的光学显微镜和扫描电子显微镜病理观察,可以初步确定该病为斑石鲷上皮囊肿病.这是上皮囊肿病在中国养殖斑石鲷中首次被发现和记载.     

大型围栏养殖模式下2种规格斑石鲷耐高温研究

鱼类作为水生变温动物,围栏圈养环境海水温度的突变会对其机体正常的生理活动产生显著影响。本研究以2种规格斑石鲷(Oplegnathus punctatus)为实验对象,分析了急性高温(32℃)胁迫后1、3、6 h,恢复正常温度(25℃)后6 h和12 h时,其呼吸频率、血清中葡萄糖(GLU)和皮质醇(COR)含量、血液中红细胞(RBC)和白细胞(WBC)数目、血红蛋白(HGB)含量、红细胞积压(HCT)以及肝脏热休克蛋白(hsp70、90) mRNA表达量的变化。结果显示,32℃高温条件下,2种规格斑石鲷呼吸频率呈先升高后降低的变化趋势,其中,50 g和200 g斑石鲷分别在0.3 h (20 min)和1 h时呼吸频率达最高值(P<0.05)。2种规格斑石鲷COR和GLU浓度皆呈先升高后降低的变化趋势,50 g斑石鲷COR浓度在1 h时显著高于其他处理组(P<0.05),GLU浓度在6 h时显著高于其他处理组(P<0.05);200 g斑石鲷COR浓度在1 h时显著低于50 g斑石鲷血清COR浓度(P<0.05),恢复6 h后,COR浓度与对照组相比无显著差异(P>0.05),GLU浓度在高温胁迫期间一直处于较高水平,恢复12 h时与对照组相比无显著差异(P>0.05)。高温胁迫过程中,50 g斑石鲷WBC、RBC、HGB含量呈先上升后下降的趋势,200 g斑石鲷WBC、RBC、HCT处理组与对照组相比无显著差异(P>0.05),HGB含量呈先上升后下降的趋势,3 h时显著高于对照组(P<0.05)。高温诱导2种规格斑石鲷肝脏组织中hsp70和hsp90 mRNA表达量皆呈先上升后下降的趋势,hsp70和hsp90 mRNA表达量分别在3 h和1 h达到最高(P<0.05)。上述指标在恢复正常温度(25℃) 12 h后,恢复至正常水平,同对照组无显著差异(P>0.05)。综上,急性高温刺激显著增加了2种不同规格斑石鲷的呼吸频率、COR和GLU含量,上调了肝脏hsp70和hsp90 mRNA表达,小规格的斑石鲷应对高温胁迫具有更强适应调节能力。相关结果为斑石鲷大型围栏养殖提供了有效数据支撑,同时也为进一步阐明斑石鲷高温耐受调控机制奠定了基础。     

“矶钓之王”斑石鲷,养殖利润破百

物以稀贵,野生斑石鲷稀缺,价格高昂,不无道理,莱州明波水产有限公司（下称＂明波水产＂）成功繁育斑石鲷苗这一消息确实让人振奋,但兴奋之后,不得不面临一个严峻的问题——养殖斑石鲷是否有难度？市场接受度是否有困难？人工养殖后的斑石鲷还能是＂贵族＂吗？＂养殖不难,用配合饲料、海水鱼或是鲆鲽类的饲料喂养即可,如果有人担忧会因养殖量过大而导致市价下滑,我可以说，这完全不用担心。”明波水产总经理李波给了本刊记者一颗安心丸。显然、明波水产在繁育成功后已考虑到这一问题，并做好了相关的试验和应对措施。     

黄鳍鲷白细胞介素1β基因2种表达载体的构建

根据黄鳍鲷白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)基因全长cDNA序列(GenBank登录号为AY669059)设计、合成1对特异性引物,扩增编码黄鳍鲷IL-1β基因前体肽的基因序列,通过T-A克隆构建了克隆载体pMD18T-IL1β。以克隆载体pMD18T-IL1β为模板,以设计合成的带酶切位点的引物分别扩增黄鳍鲷IL-1β的前体肽和预测的成熟肽基因序列,经BamHI和SalI双酶切后将其插入表达载体pQE30中,构建了原核表达质粒pQE30-pIL1β和pQE30-mIL1β。经酶切、PCR鉴定并最终通过序列测定表明,基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框都正确无误,为黄鳍鲷IL-1β基因的体外重组表达研究打下了基础。     

黄鳍棘鲷重组IL-1β的表达及生物学活性检测

将扩增得到的黄鳍棘鲷Acanthopagrus latus白细胞介素1β（Interleukin 1β,IL-1β）基因克隆到表达载体pQE30,并转化到大肠杆菌M15中进行表达。采用Ni^2＋-Chelating Sepharose FF层析对重组蛋白进行纯化,并用梯度透析对纯化蛋白进行复性。经SDS-PAGE和Western Blot分析,获得了分子量为21kD的重组白细胞介素1β（Recombinant Interleukin 1β,rIL-1β）。采用Percoll不连续密度梯度离心分离黄鳍棘鲷头肾白细胞,在分离液密度1．080g／ml的界面上可以有效富集白细胞。用不同终浓度的rlL-1β和5μg／ml脂多糖（LPS）刺激培养的黄鳍棘鲷头肾白细胞,23℃培养4h后提取细胞的总RNA,经RT-PCR半定量检测,当培养基中rIL-1β的浓度达到20ng／ml时可以提高IL-1β基因的转录水平,与5ug／ml LPS的刺激效果相当,表达的重组蛋白表现出很好的生物学活性。