百子莲脱水素基因ApSK_3对逆境与激素信号的应答模式与调控机制

克隆了百子莲(Agapanthus praecox)脱水素基因ApSK_3上游2 195 bp的启动子序列,对百子莲不同组织和多种非生物胁迫与ABA处理的样品进行基因定量分析,构建多个ApSK_3不同长度缺失的启动子片段与GUS基因融合的表达载体并转化拟南芥,以揭示ApSK_3基因对不同逆境与激素信号的应答模式及顺式作用元件的调控功能。结果表明:ApSK_3启动子序列包含多个与植物逆境、激素应答及生长发育相关的顺式作用元件,且ApSK_3的表达具有组织特异性,果实中表达量最高,叶、根次之,花中最低;ApSK_3对ABA信号与盐胁迫最敏感,其次为干旱、高渗和低温胁迫,对高温胁迫响应不明显。ApSK_3-P::GUS融合表达载体转化拟南芥,ApSK_3启动子在拟南芥的整个生长发育过程中均具有较强的表达活性,幼苗根部的表达活性强于叶片,且随着果实的发育成熟启动子的活性明显增强。ApSK_3不同长度缺失的启动子片段分析结果表明–2 175～–950 bp片段对启动子的活性起到重要的调控作用;多个顺式作用元件响应干旱胁迫;ApSK_3-P通过两个ABRE元件共同响应ABA信号;–526～–533 bp的ERE元件参与响应乙烯信号;–561～–567 bp的P-box元件响应了赤霉素信号,–2 175～–1 167 bp区域可以增强对GA的响应。研究结果证明ApSK_3启动子可积极响应干旱、渗透、盐、低温、ABA、GA和乙烯信号;启动子上存在多个顺式作用元件响应干旱胁迫,ApSK_3-P通过两个ABRE、ERE与P-box元件分别响应ABA、乙烯与赤霉素信号。     

大蒜生物钟基因AsRVE1和AsRVE2及其在渗透胁迫下的表达分析

为了解大蒜生物钟相关基因REVEILLEs(RVEs)的序列特征及其在渗透胁迫下的功能,从大蒜中克隆得到AsRVE1和AsRVE2基因,并对其在盐胁迫和模拟干旱胁迫下的表达特征进行了分析。序列分析表明,AsRVE1和AsRVE2分别含有1 050和975 bp的开放阅读框,编码349和324个氨基酸。在进化关系上,大蒜AsRVE和AsRVE2与玉米ZmRVE2和凤梨AcRVE2的较近。不同植物RVE氨基酸序列同源性较低,但N端保守结构域序列一致性较高。AsRVE1和AsRVE2均能响应昼夜节律的变化,在大蒜不同组织中均能表达,在不同组织间AsRVE1的表达差异不大,AsRVE2在根中表达相对较高。干旱胁迫和盐胁迫在不同组织内均诱导了AsRVE1和AsRVE2的表达。结果表明,AsRVE1和AsRVE2可能参与了大蒜植株抵御盐胁迫和干旱胁迫的过程,可进一步鉴定其生物学功能。     

光皮桦BBX类基因BlCOL13的克隆与表达分析

利用RACE、RT-PCR以及基因组步移技术克隆得到光皮桦BlCOL13全长cDNA（GenBank登录号：KP663425）、全长DNA及其启动子序列。该基因DNA全长2 808 bp,具有4个外显子,3个内含子;cDNA全长1 370 bp,包含1 140 bp的开放阅读框,编码含379个氨基酸的蛋白。BlCOL13蛋白N、C端分别有两个B-box和一个CCT结构域,属于典型的BBX蛋白。以拟南芥中BBX蛋白的分类为参照,通过聚类分析表明BlCOL13属于Ⅱ型BBX蛋白;克隆得到的BlCOL13启动子序列长685 bp,含有多个与成花、光响应、激素信号转导以及逆境胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位试验结果表明该基因主要在细胞核中表达。不同组织中该基因都有一定程度的表达,但在雄花中表达量最高。低温、干旱、ABA和盐胁迫等非生物逆境都在一定程度上诱导BlCOL13的表达,盐胁迫的影响最为明显,表明该基因在光皮桦逆境响应中可能发挥比较重要的作用。     

津田芜菁BrPIP1的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆得到津田芜菁(Brassica rapa ssp.rapifera‘Tsuda’)质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)基因全长cDNA序列,命名为BrPIP1(GenBank登录号为KJ173685),全长为1 056 bp,开放阅读框为861 bp,编码286个氨基酸。荧光定量PCR分析BrPIP1在不同组织以及其在温度、脱水、渗透、ABA和盐等非生物胁迫条件下幼苗中的表达表明,该基因表达具有组织特异性,在花瓣中表达量最高,花蕾中次之;在上述非生物胁迫下表达量都有不同程度增加,暗示BrPIP1在非生物胁迫应答中发挥作用。     

甜瓜CmCRL1的克隆与表达分析

以甜瓜(Cucumis melo L.)品系‘L8’为试材,采用PCR方法克隆到CmCRL1(Crown Rootless1)基因,登录号为MELO3C012908,并通过Real-timePCR方法检测了CmCRL1的组织表达特异性和对低温、山梨醇、PEG6000、盐胁迫和淹水胁迫的响应模式。结果显示:CmCRL1含2个外显子和1个内含子,cDNA序列长度为996 bp,开放阅读框(ORF)长度为732 bp,编码243个氨基酸;CmCRL1蛋白中存在1个保守的LOB结构域,属于LBD/AS2(Lateral Organ Boundaries Domain/Asymmetric Leaves2)家族成员;多重比对分析发现CmCRL1与黄瓜Csa3G396920、西瓜Cla005992、拟南芥AtLBD16和AtLBD29、水稻OsCRL1、玉米ZmRTCS和ZmRTCL的LOB结构域高度保守,序列相似性分别为100%、99.02%、74.51%、86.27%、88.24%、89.22%和80.39%;组织表达特异性分析显示CmCRL1在根中优势表达,表达量分别是子叶、下胚轴、上胚轴、叶片和茎尖的178.39倍、7.54倍、26.95倍、65.19倍和75.86倍;Cm CRL1能响应低温、山梨醇、PEG6000和盐等胁迫;此外,在淹水胁迫下甜瓜不定根发生过程中CmCRL1表达上调。     

芹菜NAC转录因子基因AgNAC1的克隆及其对非生物胁迫的响应

通过RT-PCR方法,从芹菜‘六合黄心芹’和‘文图拉’中分别克隆获得编码NAC转录因子的基因AgNAC1。利用生物信息学方法分析其编码氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等,采用荧光定量PCR技术检测基因在不同非生物胁迫下的表达水平。结果表明：‘六合黄心芹’和‘文图拉’AgNAC1开放阅读框长度均为957 bp,编码318个氨基酸,其蛋白质相对分子量分别为36.89和36.77 kD,理论等电点分别为5.94和5.78。AgNAC1蛋白与不同植物中NAC家族成员同源性比对和进化树分析表明,其与胡萝卜DcNAC属于同一个分支,进化距离最近。蛋白功能域预测显示,AgNAC1有多个α螺旋和β转角二级结构单元。荧光定量PCR结果表明,AgNAC1在芹菜叶中表达量最高,具有组织特异性,同时对高温、低温、干旱和盐胁迫均有响应。‘六合黄心芹’中AgNAC1的表达水平在高温处理24 h达到最高。‘文图拉’中AgNAC1的表达水平在高温、低温及盐处理后2 h和8 h高于对照,呈现先下降后上升的趋势,在干旱处理4 h时表达水平最高。     

‘黄冠’梨类甜蛋白编码基因PbPR5的克隆及其表达特性分析

【目的】分离和克隆类甜蛋白基因Pb PR5,了解其在‘黄冠’梨不同组织、不同发育阶段以及受到非生物胁迫和植物生长调节剂处理时的表达情况。【方法】以‘黄冠’梨(Pyrus bretschneideri‘Huangguan’)组培苗为试验材料,从水杨酸(salicylic acid,SA)处理的c DNA文库中克隆获得该基因全编码区序列,命名为Pb PR5,对其进行生物信息学分析,并研究该基因在盐、聚乙二醇(EG6000)、SA和乙烯(ETH)处理后的表达情况;以12 a生‘黄冠’梨的叶片和果实为材料,探究该基因在叶片和果实不同发育阶段的表达模式。【结果】Pb PR5的c DNA序列长度为741 bp,编码224个氨基酸残基;该基因的基因组DNA序列长度为813 bp,包含1个内含子。生物信息学分析表明,Pb PR5蛋白与其他植物PR5基因编码的氨基酸序列相似性较高。实时荧光定量PCR分析表明:Pb PR5基因在‘黄冠’梨组培苗的根,茎,叶中均能表达,其中根部的表达量高于茎和叶;盐和干旱胁迫诱导了该基因表达,根和茎中的表达高峰均出现在处理后6 h,叶在盐胁迫后24 h和干旱后12 h出现表达高峰;SA和乙烯也诱导了该基因在叶片中的表达。在不同发育阶段的叶片中,老叶表达量最高,成熟叶次之,幼叶中不表达;在不同发育阶段的果实中,成熟果实中表达量最高,幼果期和膨大期果实表达量较低。【结论】Pb PR5基因在‘黄冠’梨各组织中非组成型表达,并且在‘黄冠’梨抵御生物和非生物胁迫过程中可能具有重要的生物学功能。     

苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定

利用生物信息学的方法,对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测,并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析,同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR,检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫(包括盐、低温、ABA、干旱)的响应,结果表明,MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外,通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能,MdCBL1过量表达明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。     

‘月月粉’月季PP2C家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

利用生物信息方法从月季‘月月粉’(Rosa chinensis ‘Old Blush’)基因组中共鉴定出69个PP2C家族成员,其编码氨基酸的长度在122～1 082 aa之间,等电点介于4.03～9.34,大部分蛋白呈亲水性。系统进化树分析将其分为12个亚族,同一亚族内基因结构和保守基序具有较高的相似性。基因片段复制事件是PP2C家族基因扩张的主要原因。启动子顺式作用元件分析表明约85%的月季PP2C含有逆境应答元件、激素应答元件等,推测其在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。月季PP2C基因的表达具有组织和发育时期特异性,且部分基因参与干旱和高温胁迫响应过程,其中3个A亚族基因在干旱胁迫中响应明显,1个A亚族基因和2个G亚族基因在高温胁迫中响应明显。通过qRT-PCR分析11个不同亚族PP2C基因在月季失水胁迫和ABA处理下的表达模式,发现6个A亚族基因(RC0G0099200、RC1G0458700、RC1G0569200、RC2G0066800、RC2G0089100和RC5G0571100)和1个G亚族基因(RC3G0083700)的表达量显著升高,表明这些基因可能受ABA诱导...     

菜薹抽薹相关基因BrcuDFR-like/BrcuAXS 的克隆与表达特性分析

 为了预测抽薹相关基因BrcuDFR-like/BrcuAXS 的功能,通过PCR 和RACE 的方法克隆了菜薹BrcuDFR-like/BrcuAXS 基因的cDNA 和gDNA 全长序列。结果表明：该基因编码区全长1 332 bp,编码312 个氨基酸残基。对应的gDNA 全长为2 460 bp,含有8 个外显子和7 个内含子,内含子总长为1 042bp,其中第3 个内含子最长,为401 bp。内含子中含有多个基本转录元件和顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素响应元件、参与抗性和胁迫应答元件、热响应元件、WRKY 转录因子的结合位点及干旱胁迫元件MYB 转录因子结合位点等。利用半定量RT-PCR 分析表达模式,发现BrcuDFR-like/BrcuAXS 随菜薹花芽形态逐步建成直至抽薹开花,其表达量逐渐增强,与其它物种DFR-like 基因的表达模式更吻合,由此预测该基因在菜薹生长发育阶段编码DFR-like 酶的可能性大于编码AXS 的可能性,其功能可能与菜薹营养分生组织向花分生组织转变有关。     

猕猴桃OSCA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

【目的】揭示OSCA家族基因在猕猴桃响应非生物胁迫中的表达特征,为猕猴桃OSCA基因功能分析与猕猴桃抗逆性遗传改良提供参考。【方法】利用生物信息学方法对全基因组范围内猕猴桃OSCA基因家族成员进行鉴定和综合分析,通过q RT-PCR法分析它们在不同非生物胁迫下的表达特征。【结果】在中华猕猴桃基因组中共鉴定出16个OSCA基因,它们不均等地分布于13条染色体上,其启动子区域存在大量响应逆境胁迫的顺式作用元件。OSCA3在干旱、盐、高温和低温胁迫下表达量均较显著上调,OSCA8在干旱、盐和低温胁迫下表达量显著上调,OSCA1和OSCA14在低温胁迫处理下表达量显著上调,OSCA7和OSCA15均显著响应干旱胁迫。【结论】鉴定出6个受非生物胁迫显著诱导表达的猕猴桃OSCA基因,为进一步研究OSCA基因在响应猕猴桃非生物胁迫中的分子功能提供了重要依据。     

岷江百合蛋白激酶基因lilyABC1的克隆及在非生物胁迫下的表达特性分析

以野生型岷江百合（Lilium regale Wilson）为材料,克隆岷江百合蛋白激酶基因lilyABC1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为百合抗逆育种提供候选基因。结果表明：lilyABC1基因全长cDNA序列为2 333 bp,其开放阅读框（ORF）为2 007 bp。该基因编码668个氨基酸,预测lilyABC1蛋白分子量为74.84 kD,等电点为5.46,含有一个高度保守的结构域--STYKc。lilyABC1基因在岷江百合的叶片、鳞片、花蕾组织中均有表达,表达量依次为叶 > 花蕾 > 鳞片,其中不同时期的花蕾中的表达量基本一致。lilyABC1的表达受到NaCl、低温、高温以及黑暗胁迫的诱导,对PEG-6000的模拟干旱处理不敏感,表明lilyABC1基因可能对岷江百合适应高盐、低温和黑暗等非生物胁迫具有一定作用。     

甜瓜Dof家族全基因组鉴定与表达分析

基于甜瓜全基因组数据信息,利用生物信息学方法对甜瓜Dof家族基因进行了全面鉴定和系统发育分析,并通过Real-time PCR方法检测了CmDof家族成员对模拟干旱(PEG6000)、盐和低温胁迫的应答。结果表明:在甜瓜中存在34个Dof基因,除1、5和7号染色体外其余染色体均有分布,发生11次染色体片段重复事件和2次串联重复事件,外显子数在1～3之间,其蛋白质等电点在4.95～9.59之间;蛋白序列系统发育分析显示CmDof蛋白可分为9个进化亚群;组织表达模式分析发现该家族基因具有一定的时空表达特异性;多数CmDof基因对PEG6000、盐和低温胁迫有响应,其中CmDof3/CmDof5/CmDof10/CmDof17、CmDof3/CmDof5/CmDof10和CmDof3/CmDof5/CmDof32分别响应PEG6000、盐和低温胁迫。     

葡萄类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因VvCBL4的克隆与表达分析

【目的】在京秀(Vitis vinifera‘Jingxiu’)葡萄中克隆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因Vv CBL4及其启动子,分析Vv CBL4的表达特性与逆境胁迫的关系。【方法】用RACE技术克隆Vv CBL4的全长,实时荧光定量PCR检测Vv CBL4在不同逆境下的表达;用同源克隆技术获得Vv CBL4的启动子,在烟草叶片中瞬时表达分析Vv CBL4启动子的活性。【结果】Vv CBL4全长为959 bp,ORF为642 bp,编码213个氨基酸,具有3个EF手钙结合结构域。Vv CBL4在根部表达量最高,其次是果实。Vv CBL4的转录本能对干旱、低温和盐胁迫处理快速做出响应。Vv CBL4启动子富含与逆境响应相关的顺式作用元件。干旱、低温和盐胁迫处理能够增强启动子活性。【结论】获得Vv CBL4及其启动子序列,Vv CBL4的表达能对逆境胁迫做出响应,Vv CBL4启动子的活性受逆境胁迫诱导,说明Vv CBL4在葡萄逆境胁迫反应中具有重要的作用。     

萝卜水通道蛋白基因RsAQP1b的表达模式及功能分析

以萝卜品种白玉春为材料,利用同源克隆的方法获得萝卜水通道蛋白基因Rs AQP1b的编码序列全长,在萝卜苗期干旱胁迫下分析Rs AQP1b基因及蛋白的表达模式;在烟草中表达该基因,研究干旱胁迫下烟草中MDA含量及保护酶的活性变化。结果表明:萝卜水通道蛋白基因Rs AQP1b的编码序列全长861bp,编码286个氨基酸。制备了Rs AQP1b多克隆抗体,效价在1∶512000以上。RealtimePCR与Westernblot检测表明,干旱胁迫导致Rs AQP1b基因与蛋白的表达水平整体下降。PEG6000干旱处理下的转基因与野生型烟草MDA含量都增加,但是转基因烟草的增加幅度小;随着干旱程度加重,转Rs AQP1b基因烟草中SOD含量呈上升趋势,CAT含量呈先上升后下降趋势,POD含量呈上升趋势,酶活性均高于相应野生型对照。     

矮牵牛B-box型锌指蛋白基因PhBBX8的克隆与表达分析

利用矮牵牛（Petunia hybrida）基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的相关基因,从中发现1个B-box型锌指蛋白基因PhBBX8。通过RT-PCR克隆得到该基因的编码区序列（CDS）,为1 242 bp,预测其编码氨基酸413 aa,N端含有2个B-box盒,C端含有1个CCT结构域。系统进化树分析发现,PhBBX8与拟南芥AtBBX8等聚类为一支。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性,结果表明该基因在花中表达量较高,其次为根,而在茎和叶中表达较弱;利用实时定量PCR检测了在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下矮牵牛叶片中PhBBX8的诱导表达情况,结果表明,PhBBX8表现出不同程度的上调,其中除干旱胁迫外,其他胁迫下上调倍数都较高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温等非生物逆境相关。     

核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】Q型C2H2锌指蛋白在植物抵抗非生物胁迫中起重要作用。为深入了解核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族在核桃全基因组中的特征,对核桃Q型C2H2锌指蛋白(JrZFP)基因家族进行全基因组鉴定与分析,并研究其在核桃干旱和盐胁迫应答过程中的表达模式。【方法】利用生物信息学方法鉴定了核桃全基因组中的Q型C2H2锌指蛋白基因家族成员,并对其理化性质、染色体定位、进化关系和基因结构进行分析;根据JrZFP基因家族进化树随机挑选15个JrZFP基因,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)方法检测15个基因在干旱和盐胁迫下的响应特性。【结果】在核桃中共鉴定出82个Q型C2H2锌指蛋白基因,其蛋白质序列长度介于59～636个氨基酸之间,亚细胞定位主要位于细胞核中;该基因家族成员不均匀分布在15条染色体上,其中有11对JrZFPs基因为串联重复基因,63个JrZFP基因参与片段重复事件;基因结构分析表明,75个JrZFP基因无内含子,其余成员含有1～10个外显子;上游启动子区分析发现,该基因家族成员含有参与逆境胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。...     

外源Spd对盐胁迫下黄瓜SAMs基因表达的影响及SAMs蛋白的生物信息学分析

 以黄瓜品种‘津春2号’为材料,采用营养液栽培,研究了外源亚精胺（Spd）对NaCl胁迫下黄瓜幼苗S–腺苷甲硫氨酸合酶基因（SAMs）表达的影响,分析了SAMs的生物学信息。结果表明,在75 mmol · L-1 NaCl胁迫下,SAMs基因在盐胁迫3、6和12 h内诱导表达上调,24 h后表达受到抑制,低于对照水平;盐胁迫下,外源Spd处理在3、6和12 h内下调了SAMs基因表达,24 h后表达量接近对照水平,表明外源Spd介导了盐胁迫下黄瓜幼苗SAMs基因的差异表达,可能通过修正SAM合成途径响应盐胁迫,增强黄瓜植株耐盐性。黄瓜SAMs蛋白生物信息学分析表明,SAMs蛋白比较稳定,含有多个磷酸化位点,其氨基酸序列中第89位半胱氨酸残基和246 ~ 255位的保守序列DAGLTGRKII对SAMs酶的功能起着重要的作用,同时推导了黄瓜SAMs蛋白的三维结构。     

南瓜肌醇单磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆与表达分析

以中国南瓜（Cucurbita moschata）为试验材料,利用同源克隆和南瓜转录组unigene序列获得2个IMP基因的全长cDNA序列,将两个基因命名为CmIMP1和CmIMP2,GenBank登录号为KP735607和KP735608。CmIMP1基因cDNA全长1 053 bp,包含1个810 bp的ORF,共编码269个氨基酸;CmIMP2基因cDNA全长945 bp,包含1个807 bp的ORF,共编码268个氨基酸。序列分析发现两个基因均含有磷酸酶家族锂敏感的3个特殊结构域,系统进化树分析表明这2个南瓜CmIMP与其他植物IMP有较高同源性（63.8% ~ 94.0%）,并与葫芦科作物最接近。采用荧光定量PCR研究CmIMP在各组织及逆境条件下的表达模式显示,其表达具有组织特异性,在叶中表达最高,须和幼果次之;盐胁迫和干旱胁迫可强烈诱导CmIMP表达,ABA对CmIMP的诱导较微弱,推测CmIMP在南瓜响应非生物胁迫的分子调控机制方面发挥重要作用。     

枣树ZjSOD1基因参与非生物胁迫响应的研究

【目的】克隆1个枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD1,并对其功能进行研究,为其在枣树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础。【方法】采用PCR克隆ZjSOD1 cDNA序列,运用实时定量RT-PCR方法研究其在高盐和PEG6000胁迫下转录水平的变化。构建ZjSOD1过量表达载体转化拟南芥,研究其在拟南芥中响应非生物胁迫应答的功能,测定氧化酶活性及生理指标。【结果】ZjSOD1基因cDNA序列开放阅读框全长为699 bp,编码232个氨基酸,理论等电点为8.59,属于Fe-SOD家族成员。在转录水平上,ZjSOD1明显受NaCl和PEG6000诱导。在拟南芥中过量表达ZjSOD1基因导致植株对干旱、高盐更加敏感,但对H_2O_2耐受性显著增强。在NaCl、PEG6000和H_2O_2胁迫条件下,过量表达ZjSOD1转基因植株中SOD、CAT和POD酶活性、脯氨酸和丙二醛含量、电解质渗透率均显著发生改变。实时定量RTPCR结果显示参与活性氧(ROS)、高盐和干旱胁迫相关信号通路的基因在ZjSOD1转基因株系中表达量发生明显改变。【结论】ZjSOD1在植物生长发育过程中参与氧化、干旱、高盐胁迫应答。