不同培养条件和卵母细胞来源对黄牛卵母细胞第一极体排出的影响

研究了培养液组分浓度、培养方法和卵母细胞来源对黄牛卵母细胞第一极体(PB1)排出的影响。从屠宰场收集黄牛卵巢,使用抽吸法获取卵丘卵母细胞复合物(COCs)进行体外培养。结果表明,采用以下培养条件能够显著促进黄牛卵母细胞PB1排出:在培养液中添加10μg·mL-1FSH和LH、1.0μg·mL-117-βE2、33.0μg·mL-1丙酮酸钠;培养时间24 h,培养密度每50μL培养液培养10～20枚COCs;卵巢储运温度25～37℃,储运时间<3 h,卵泡直径3～6 mm,卵丘细胞包裹2层以上。选择最佳的培养液组分浓度、培养方法和卵母细胞来源可获得最大PB1排出量,为下一步利用PB1进行保护物种、扩大优良母畜遗传资源的来源和植入前遗传学诊断等研究提供参考。     

绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

【目的】在绵羊有腔卵泡发育过程中,多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊结构,存在于卵泡腔内。卵泡成熟后,绵羊COC从卵泡内排出,进入输卵管,等待受精。现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术,或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理,或者将COCs从卵泡内分离,在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色。但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时,存在显著缺陷。研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进,以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求。【方法】首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs,以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的"包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构"。然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象,分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程,检测了目的蛋白,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与其受体(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在绵羊COCs中的表达情况,比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异。【结果】将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织,进行石蜡组织切片处理,经切片、贴片与脱蜡等步骤,分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层(厚度5μm)。经间接免疫染色处理后,结果显示:①目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的,即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达,而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中;②在绵羊COCs薄片结构中,COCs整体形态完好,卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄层结构中,绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整,卵母细胞蛋白定位清楚,但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰;③与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较,绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术,在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短,例如固定处理由24h缩短为2h;由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h;透明由30min缩短为10min;软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h;由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等。【结论】改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术,显示更优质的免疫定位与染色效果,不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点,而且显著缩短了操作时间,简化了操作流程。该技术在保留COCs结构完整的基础上,有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式,对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制,具有重要意义。     

促卵泡素对犬卵母细胞体外成熟的影响

为探究基础培养基中添加促卵泡素(FSH)对犬卵母细胞体外成熟的影响,采用切割法收集卵巢表面的卵丘卵母细胞复合体(COCs),培养在添加不同浓度FSH(0,0.1,1,10 IU/mL)的TCM-199基础培养液中.体外培养72 h后,对卵母细胞进行染色观察其细胞核成熟情况.结果表明,FSH的添加没有增加犬卵母细胞恢复减数分裂的细胞数量.此外,不同处理对卵母细胞卵丘扩散无差异.     

猪卵母细胞极体排出的规律

试验把猪卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,观察它们在不同时间排出的极体数,以研究体外卵母细胞排出极体的规律.结果表明,A级和B级的COCs培养48 h的极体排出率最高(83.2％和65.7％),明显高于同级水平培养24...     

牦牛卵母细胞体外成熟培养及孤雌发育研究

牦牛体外胚胎培养作为辅助生殖策略，能够有效提高其繁殖能力。为研究牦牛卵母细胞体外培养过程中不同的处理方式对孤雌激活胚胎发育质量的影响，10月份采集5～8岁健康母牦牛卵巢，抽吸法收集卵母细胞进行体外成熟诱导，设置卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexs,COCs）和裸卵2个试验组；TCM199培养时间分别为24、36 h；以及体外培养12 h的COCs，消化之后再移入TCM199培养12 h）分别进行孤雌激活，在体外进行孤雌胚胎培养，统计卵裂率和囊胚率。结果显示，牦牛COCs的孤雌激活胚胎发育率显著低于裸卵（P<0.05），且后期出现脱卵丘细胞现象；COCs在TCM199中培养24 h的孤雌胚胎卵裂率明显高于培养36 h的处理组（P<0.05）；裸卵再培养之后卵母细胞成熟率低、进行孤雌激活的卵裂率极低，且大部分发生贴壁。以上结果表明，体外培养24 h的COCs经透明质酸酶消化为裸卵的孤雌激活效果最佳，其卵裂率最高，囊胚率最高。研究结果为揭示牦牛卵母细胞孤雌激活前的不同处理方式与孤雌激活胚胎的发育质量提供了依据，可为优化卵母细胞体外培养、提高孤雌激活...     

组织切片法观察昆明白小鼠卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系①

本实验应用组织切片法探讨了体内正常生理条件下昆明白小鼠卵巢内卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系。初情期前小鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG）,48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）,于注射HCG后不同时间取出卵巢进行组织切片。注射HCG后1 h,卵丘细胞开始扩展,此时卵母细胞核膜完整,即未发生生发泡破裂（GVBD）;注射HCG后3 h,大部分(＞70%)大有腔卵泡中卵母细胞发生GVBD,此时卵丘处于2级扩展状态。卵丘完全扩展发生在注射HCG后9 h,而PB1的排出是从12　h开始的。结果表明在小鼠体内,卵丘开始扩展先于卵母细胞成熟,但卵母细胞成熟并不需要卵丘完全扩展;促性腺激素能促进卵泡发育及卵母细胞成熟,同时也具有促使卵泡退化的功能。     

膨润土中硫酸盐还原菌对As和N的还原作用

通过微宇宙实验,探究厌氧条件下不同硫酸盐还原菌（Desulfovibrio vlugaris Miyazaki,SRB）活性、外源氮添加量和有机物对膨润土固-液体系中砷（As）和氮（N）形态及浓度的影响,以及二者间的联系。结果表明：与超纯水环境相比,在适宜SRB生长的标准培养液中,As （Ⅴ）从第0天就开始还原成As （Ⅲ）,在第7天时As （Ⅲ）达到1 947 μg·L^-1,明显高于超纯水环境中的As （Ⅲ）浓度（1 341 μg·L^-1）。同时,生物还原作用下3种不同细菌生长环境中的NO₂^-和NH₄⁺都有升高的趋势。在没有外源N添加的控制组,几乎检测不到As （Ⅲ）,而在低氮和高氮两种N水平的实验组中,As （Ⅲ）浓度分别高达427 μg·L^-1和1 341 μg·L^-1,成铵作用和反硝化作用随着N源的输入也变得明显。高低两种水平乙酸钠的添加极大地提高了As （Ⅴ）的还原量,得到的平均As （Ⅲ）浓度分别为控制组的2.0倍和2.5倍。但腐植酸的加入使得As（Ⅴ）还原量减少。进一步实验探究NO₂^-和As（Ⅲ）的关系,其实验结果显示：亚硝酸钠直接加入As （Ⅴ）溶液共存体系后,可在5 h内将As （Ⅲ）的浓度由低于检测范围提高至14.6 μg·L^-1,因此NO₂^-可以作为反应中的电子供体,直接参与As （Ⅴ）还原反应。     

萝卜苗中微量元素硒的生物转化能力研究

分别采用浓度为0、10、20、40、60、80 和100 μg·mL^-1的亚硒酸钠溶液对萝卜籽浸泡处理8 h,而后于25℃进行发芽培育,研究不同硒溶液浓度处理条件下,发芽萝卜苗中微量元素硒的生物转化能力。研究发现,经不同浓度的亚硒酸钠溶液处理后,萝卜苗中硒富集因子随硒溶液浓度增大而逐渐减小,但总硒和有机硒含量先极显著增加（P<0.01）而后再减少,当硒溶液浓度为80 μg·mL^-1时达最大值。硒的生物转化能力与有机硒、总硒的变化趋势相似,当硒溶液浓度为80 μg·mL^-1时,生物转化能力最高,达88.756%左右。可见萝卜苗在生长发育过程中对硒元素具有较强的生物转化能力。     

长枝木霉T6与阿维菌素复配对禾谷孢囊线虫的室内毒杀效果

旨在采用室内毒力测定法测定长枝木霉与阿维菌素复配对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀效果。试验结果表明，单一长枝木霉T6菌株分生孢子悬浮液和阿维菌素对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均表现出较好的毒杀效果，且不同浓度之间存在显著差异，随着处理浓度和时间的增加，毒杀作用增强。经2.0×10⁷ cfu·mL^-1的木霉分生孢子悬浮液和0.5 μg·mL^-1的阿维菌素溶液处理2龄幼虫48 h后，线虫死亡率分别达到71.43%和60.28%；当长枝木霉T6与0.5 μg·mL^-1的阿维菌素溶液按1∶1比例复配时，其对2龄幼虫的毒杀活性最佳，处理48 h后线虫死亡率高达96.30%，其毒杀作用显著优于单一长枝木霉T6和单一阿维菌素溶液。     

八角枫内生真菌的分离鉴定及其发酵产物对松材线虫的毒杀活性

旨在筛选对松材线虫具有毒杀作用的生防真菌。通过组织分离法从八角枫茎、叶组织中共分离得到11株内生真菌,经摇瓶培养、乙酸乙酯萃取制备次生代谢产物,采用浸渍法开展内生真菌代谢产物对松材线虫的室内毒力试验,结合形态特征和ITS序列分析对活性菌株进行鉴定。结果表明,一株内生真菌（BZ-8）发酵液杀线虫活性显著,通过形态学与分子生物学均鉴定为Aspergillus japonicus,其发酵液有机相24 h和48 h的IC₅₀值分别为0.29 mg·mL^-1和0.21 mg·mL^-1,水相24 h和48 h的IC₅₀值分别为0.04 mg·mL^-1、0.02 mg·mL^-1。研究结果说明,八角枫内生真菌A.japonicus的胞外次生代谢产物对松材线虫具有显著的毒杀效果,值得进一步研究。     

SLCO1C1基因与鸡绿壳蛋形成的关系

【目的】分析位置候选基因SLCO1C1与绿壳蛋形成的关系,为绿壳蛋鸡提纯提供参考。【方法】以江西东乡绿壳蛋鸡为研究对象,以同群体的褐壳蛋鸡为对照,检测SLCO1C1基因上游6.5kb区域内的序列变异情况;采用Real-time PCR法检测SLCO1C1在蛋鸡脑、肝、脾、蛋壳腺中的表达情况,用3′RACE法克隆SLCO1C1 3′UTR,用PCR-RFLP法检测Ala528Glu错义突变基因型。【结果】在SLCO1C1基因上游6.5kb区域内共发现了33个单核苷酸变异(SNP),这些SNP与绿壳性状显著关联(P<0.05)。表达结果显示,SLCO1C1基因只在蛋鸡脑中表达,且在绿壳蛋鸡(n=5)与褐壳蛋鸡(n=5)间的表达无显著差异(P>0.05)。序列比对结果显示,绿壳蛋鸡与褐壳蛋鸡的SLCO1C1 3′UTR同源性为100%。在SLCO1C1基因11号外显子上发现了一个错义突变Ala528Glu,Glu突变与绿壳性状显著关联(P<0.05),且Glu突变在其他产绿壳蛋的鸟类中也存在。【结论】SLCO1C1可能通过间接途径影响胆绿素的转运,从而影响绿壳蛋的形成。SLCO1C1基因内存在大量的与绿壳性状显著关联的SNP,表明控制绿壳性状的O基因很可能就在SLCO1C1附近。     

CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1基因在小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴的表达

为揭示类固醇生成相关基因CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1在绵羊多羔繁殖中的作用,以不同繁殖力小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术检测CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1基因在小尾寒羊大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管中的表达。结果表明:CYP11A1基因主要在小尾寒羊卵巢、输卵管、子宫内表达;CYP11A1基因在单羔小尾寒羊卵巢的表达极显著低于多羔群体(P0.01),在子宫的表达量极显著高于多羔群体(P0.01);CYP17A1基因主要在小尾寒羊卵巢、输卵管、下丘脑表达;CYP17A1基因在多羔小尾寒羊群体下丘脑、子宫的表达量显著低于单羔群体(P0.05)。CYP19A1基因主要在小尾寒羊卵巢、下丘脑表达。本究结果提示CYP11A1、CYP17A1基因可能参与小尾寒羊多羔性状的调控。     

海蒿子岩藻聚糖结构特征及其抗流感病毒活性

采用热水提取法从海蒿子中提取粗多糖,再用Q-Sepharose Fast Flow和Sepharose 4B Fast Flow纯化得到一种硫酸化岩藻聚糖,命名为SF0。通过逐步部分酸水解,该岩藻聚糖SF0被进一步分为3种次级多糖SF1、SF2和SF3,硫酸基团的含量和相对分子质量依次降低。通过单糖组成、傅里叶红外光谱(FT-IR)和¹³C-NMR谱分析了4种多糖的结构特征,并探究了其抗甲型流感(H1N1)病毒的活性。结果表明,SF0主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖组成,摩尔比为10.8∶8.3∶3.0∶21.1∶21.2∶35.6,相对分子质量为628.1 ku,由α-D-1,2-Manp和β-D-1,4-GlcAp双糖重复单元构成核心骨架。抗甲型流感(H1N1)病毒检测表明,4种多糖都可以抑制MDCK细胞中的H1N1病毒复制。低分子量组分SF3比未降解岩藻聚糖抗病毒活性更好。初步认为该岩藻聚糖的抗H1N1病毒活性与其精细结构和分子量有关。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

梅花鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子DNA甲基化模式及差异分析

为探究COL1A1基因表达的Ⅰ型胶原蛋白α1链在组成生物体结构和骨发育中的重要作用,以梅花鹿茸生长过程的小鞍子（前期）、二杠（中期）和三杈茸（后期）3个典型时期鹿茸顶端组织及其茸皮、间充质、前软骨和软骨4个组织层为试验材料,采用亚硫酸氢盐测序法（BSP技术）,从时空角度研究鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子区DNA甲基化模式及其相互间DNA甲基化差异。结果显示：1)COL1A1基因在前、中、后期的茸皮组织中的甲基化率分别为（9.73±0.92）%、（7.60±0.69）%和（3.73±0.23）%;间充质组织中的甲基化率分别为（3.20±0.40）%、（1.33±0.23）%和（1.60±0.69）%;前软骨组织中的甲基化率分别为（4.67±0.83）%、（2.53±0.46）%和（2.67±0.23）%;软骨组织中的甲基化率分别为（5.60±0.40）%、（2.80±0.40）%和（2.27±0.61）%。2)COL1A1基因启动子区的甲基化区域共有25个CG位点,在17个CG位点上均发生了不同程度的甲基化。3）对COL1A1基因启动子区DNA甲基化差异分析发现,相同时...     

优质肉鸡VIP和DRD基因多态性与性成熟的关联分析

为探究鸡血管活性肠肽受体基因(VIP1和VIP2)和多巴胺受体基因(DRD1)多态性与性成熟的关系,采用PCR-SSCP和SNPs测序验证等方法对优质肉鸡F系287个个体进行了性成熟相关性状的关联分析。结果表明,VIP1基因处发现2个突变位点,分别为73352处C→T的突变,68818处T→C的突变;VIP2基因发现1个突变为36 127处A→G的突变。DRD1基因发现3个突变位点,分别为201处C→T的突变,208处A→G的突变及255处A→G的突变。与性成熟的关联性分析表明,VIP1基因73 352处的基因突变与冠高、冠长、冠重和睾丸重显著相关(P0.05),而与生长激素GH、睾酮激素TEST差异不相关(P0.05);VIP2和DRD1各处基因突变与性成熟相关指标均存在不同程度的差异显著(P0.05),但都与生长激素GH和睾酮激素TEST差异不相关(P0.05)。结果提示说明,VIP1、VIP2和DRD1基因可作为性成熟性状标记辅助选择的有效分子标记。     

新疆部分地区环形泰勒虫Tams1基因型及遗传多样性分析

为了对新疆部分地区环形泰勒虫Tams1基因型及遗传多样性进行分析，本研究对新疆托克逊、艾丁湖、青河和伊吾地区奶牛血液DNA进行检测，采用PCR方法对Tams1基因扩增、克隆和测序，并进行序列比对。通过MEGA、DNAsp、NetNGlyc等软件及在线软件分析Tams1基因及其蛋白序列。结果显示：1)新疆地区23条环形泰勒虫序列除伊吾地区2号样品序列被归为G3型，其余均属于G1型；此外，新疆地区Tams1基因序列在核苷酸与氨基酸水平上分别具有90.1%～100%和83.9%～100%的相似性。2)Tams1序列在核苷酸的168～217和479～528位置之间可检测到广泛序列变异。通过Hd=0.994±0.006、π=0.071±0.002、S=178、h=38及k=52.32均显示Tams1序列较高的遗传多样性；中性指数结果显示当地环形泰勒虫Tams1基因单倍型数大于多态位点个数，遗传多样性呈平衡选择。3)Tams1蛋白的N末端显示出较大的序列变异性，在3个区域(氨基酸位置27～52、138～175和180～196)存在广泛变异。经B细胞抗原表位预测及3D结构同源建模，发现Tams1蛋白...     

小鼠SOCS3基因真核表达载体的构建及其对3T3-L1细胞凋亡的影响

【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和pEGFP-N1-SOCS3的核苷酸序列正确率为100%;在荧光显微镜下发现,脂质体组和SOCS3组均有GFP的表达;RT-PCR和Westernblotting检测表明,3T3-L1细胞中SOCS3mRNA表达显著提高(P<0.05);Hoechst 33258染色发现,SOCS3组的细胞凋亡显著;Bax和c-myc基因的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),bcl-2和mcl-1基因表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】SOCS3对脂肪细胞凋亡的发生有促进作用。     

华山新麦草蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因Ph-1-SST的克隆及序列分析

蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因1-SST在植物逆境胁迫反应中起重要作用。为了挖掘华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)抗非生物胁迫关键功能基因,以华山新麦草叶片为材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆1-SST基因的全长cDNA,命名为Ph-1-SST,登录号为KX761897。通过PCR法扩增其gDNA序列,测序结果表明该基因的gDNA和cDNA序列长度分别为3 344bp和2 001bp,编码666个氨基酸残基,序列结构分析结果表明该基因含4个外显子3个内含子,预测该蛋白相对分子质量为72.9ku,理论等电点为4.87。序列比对显示,该基因与大麦1-SST基因编码蛋白的相似性最高(90%),为糖基水解酶32家族成员。对1-SST氨基酸序列的系统进化树分析显示,Ph-1-SST及其同源蛋白位于不同分支,初步推断此全长cDNA是华山新麦草中编码蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的一个新基因。结果为作物非生物胁迫改良提供重要基因资源。