浦市黑猪保种群体基于SNP芯片的遗传结构分析

【目的】通过SNP芯片技术分析浦市黑猪群体遗传多样性和家系结构,为保护和利用浦市黑猪资源提供支撑。【方法】利用“中芯一号”50K SNP芯片,对79头成年浦市黑猪（10头公猪、69头母猪）进行SNP测定,采用多种分析软件（Plink、 Gmatix及Mega X）对群体遗传多样性和亲缘关系开展分析,进而构建群体家系结构。【结果】在79头浦市黑猪中共检出57 466个SNPs位点,平均基因型检出率为99.15%。遗传多样性分析提示SNP位点具有多态性,群体存在近交（有效群体含量Ne仅为1.5,且平均观察杂合度<平均期望杂合度）。群体平均状态同源（Idengtical by state,IBS）遗传距离为（0.294 9±0.072 6）,公猪为（0.277 1±0.091 8）,共检测到长纯合片段（Runs of hemozygosity,ROH）(29.60±16.12)个,其中长度在0～100 Mb的占40.5%,且群体基于ROH的平均近交系数为0.108。IBS距离矩阵、G矩阵结果以及群体ROH值的分析结果均反映出群体内个体之间存在较近的亲缘关系。根据群体进化树结果,将群体划...     

大通牦牛TLR2基因SNP位点筛选及生物信息学分析

采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,对大通牦牛TLR2基因CDS区的SNP位点进行筛选,估算各SNP位点等位基因频率,并通过生物信息学软件预测突变对TLR2 mRNA和蛋白质结构的影响。结果表明,大通牦牛TLR2基因CDS区存在2个SNP位点,分别为G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A,其中G⁶⁷⁷A为错义突变,导致半胱氨酸(Cys)转变为酪氨酸(Tyr)。生物信息学分析结果表明,G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A位点均降低了mRNA二级结构的稳定性,且蛋白二、三级结构组成也发生了改变。     

TLR4基因外显子Ⅲ|Bbv12 Ⅰ酶切位点多态性与奶牛乳房炎的相关分析

采用PCR-RFLP技术,对奶牛TLR4基因外显子Ⅲ321bp的部分序列进行多态性分析,结果发现扩增产物C到T突变处存在限制性内切酶Bbv12Ⅰ酶切位点,并且导致编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸。C、T等位基因在牛群中均有分布并且属于中度多态,C等位基因占优势。利用最小二乘拟合线性模型将基因型效应与奶牛乳房炎易感性进行关联分析,结果表明不同基因型奶牛的体细胞评分（SCS）表现出CC基因型〉CT基因型〉TT基因型的趋势,但运用SAS9．0软件统计不同基因型对体细胞评分的最小二乘均值没有显著性差异（P〉0．05）。     

广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异分析

【目的】明确广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异,为进一步阐明大型猪与小型猪的体型形成机制提供理论依据。【方法】以1日龄的广西巴马小型猪和长白猪为研究对象,采集其四肢骨生长板软骨组织提取总RNA,反转录合成cDNA后用于扩增BMP2和FGFR3基因的编码区（CDS）序列,采用PCR-RFLP检测FGFR3基因SNP位点多态性,并通过实时荧光定量PCR分析BMP2和FGFR3基因在1日龄广西巴马小型猪和1日龄长白猪生长板软骨组织中的表达差异。【结果】1日龄广西巴马小型猪与1日龄长白猪的体型差异明显,其体重、体长和体高的差异均达极显著水平（P<0.01,下同）,股骨长的差异达显著水平（P<0.05,下同）。广西巴马小型猪和长白猪的BMP2基因CDS序列全长1188 bp,且2个品种猪的CDS序列完全一致;广西巴马小型猪和长白猪的FGFR3基因CDS序列全长808 bp,与NCBI已公布的FGFR3基因序列（XM_005666479.1）比对发现存在8个碱基突变位点及1个碱基缺失位点。广西巴马小型猪和长白猪共有5个错义突变位点,分别为A124G、C190G、A204C、C205A和C245T,另外3个突变位点是广西巴马小型猪A438G和C549T的同义突变及长白猪A752C的错义突变;碱基缺失位点为长白猪第328~330个碱基（GCA）缺失。FGFR3基因A2374G和C2620T位点的基因型及基因频率在广西巴马小型猪与长白猪间的分布差异极显著,对应的等位基因分布均不符合Hardy-Weinberg平衡,且2个基因座均处于连锁平衡状态。1日龄广西巴马小型猪生长板软骨组织中的BMP2基因相对表达量显著低于1日龄长白猪,而FGFR3基因相对表达量极显著高于1日龄长白猪。【结论】BMP2和FGFR3基因在猪的软骨和骨骼形成方面具有重要意义,其中,BMP2基因对猪骨发育起促进作用,而FGFR3基因对猪骨发育起抑制作用。广西巴马小型猪体型矮小与FGFR3基因高表达及BMP2基因低表达存在直接关联。     

用高通量测序技术研究松辽黑猪与长白猪背最长肌mRNA和lncRNA的差异表达

【背景】肌肉生长和脂肪沉积是猪生产中非常重要的经济性状,同时也是复杂的数量性状,受到众多因素的影响。长白猪原产于丹麦,是目前世界上使用最为广泛的瘦肉型猪种之一,具有生长速度快,瘦肉率高等特点,但肉质欠佳。松辽黑猪是以民猪、长白猪和杜洛克猪为素材经过三元杂交育成的黑色母系地方培育品种,具有繁殖率高、肉质优良、适应性强、耐粗饲等特性。二者在肉质方面存在较大差异。【目的】采用高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪的背最长肌转录组进行分析,筛选影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA),为猪肉品质研究提供新的参考信息。【方法】采集6头松辽黑猪和6头长白猪的背最长肌作为样本,提取其RNA,将每个品种内的个体取等量RNA混池,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对混池后的样本RNA进行测序,然后对所获得的Reads进行比对、注释和差异表达等分析,筛选出差异表达mRNA和lncRNA并进行相关生物学功能富集分析。而后在筛选出的差异表达mRNA和lncRNA中各挑选10个基因,包括5个上调基因和5个下调基因,采...     

FSHR基因第10外显子SNP的筛选及其与兔体质量性状的关联性分析

【目的】近年来,研究发现FSHR基因在非性腺组织中也有表达,能够介导FSH信号参与调控机体内多项生理活动。FSH-FSHR信号与脂肪沉积、体质量存在一定关联,但有关FSHR基因与兔体质量性状的关联还未见报道。【方法】本研究以天府黑兔为研究对象,采用PCR产物直接测序的方法对其FSHR基因第10外显子进行SNP筛选,并将基因型与兔各日龄体质量做关联性分析。【结果】测序结果经比对,在兔FSHR基因第10外显子发现突变g.163537 G>A和g.163619 A>G。其中g.163537 G>A为同义突变,处于低度多态(PIC<0.25),群体处于Hardy-Weinberg平衡;g.163619 A>G为错义突变,编码氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸,同样处于低度多态(PIC<0.25),群体处于Hardy-Weinberg平衡。对单位点基因型间体质量差异进行分析发现,g.163537 G>A位点对兔体质量影响不显著,但GG基因型个体的49、56及70日龄体质量高于GA和AA基因型个体,表明GG基因型增重速度较快;g.163619 A>G的AA基...     

藏鸡和隐性白羽鸡GH基因的SNP检测及其与生长性状间的关联分析

 利用改良等位基因特异性PCR（Modified Allele Specific PCR, M-ASP）结合PCR-RFLP以及直接测序方法对藏鸡和隐性白羽鸡生长激素（Growth Hormone, GH）基因内含子4 （Intron4）的一个位点进行了SNP检测，并进行了该基因与藏鸡生长性状的关联分析。检测结果显示，GH基因Intron4的这个位点同时具有M-ASP和SacI-RFLP多态。测序结果表明，该位点发生了C→G的碱基突变，产生了CC、CG和GG三种基因型。两个等位基因和三种基因型在两鸡种中的分布基本一致。其中，基因型CC和等位基因C的频率最高。χ2检验结果表明，基因型频率或者等位基因频率在两鸡种之间没有显著差异（P＞0.05），而分别在两鸡种内部却存在显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）差异。方差分析结果表明，基因型与藏鸡的2周龄体重等12个生长性状有显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）关联；基因型CC与藏鸡的7周龄体重存在显著关联（P＜0.05）。这暗示了GH基因是影响藏鸡生长的主效基因或者它与主效基因相关，而该位点的碱基突变可以作为筛选藏鸡高的7周龄体重的分子标记。     

广益黑猪繁殖性状的全基因组关联分析

选取441头广益黑猪经产母猪为研究对象,利用猪50K SNP芯片对猪耳组织DNA进行基因型分型,PLINK 1.9质控后,采用GMAT中的重复力模型进行猪繁殖性状相关的全基因组关联分析,确定显著位点。结果表明：441头经产广益黑猪母猪的耳组织DNA基因分型共获得50 898个SNPs,经质控剩余46 165个SNPs位点用于关联分析;平均亲缘关系系数为–0.002 2,平均亲缘关系较远,不存在明显的群体分层;总产仔数性状有1个SNP在全基因组范围内达到显著相关,4个SNPs达到潜在显著关联,候选基因包括PIK3C3、ENSSSCG00000003753、MAP3K3、DCAF7;产活仔数性状有6个SNPs潜在显著关联,候选基因包括ZNF585A、ENSSSCG00000022411、ZNF784、ENSSSCG00000029007、PigE–108A11.5、PigE–108A11.3、ENSSSCG00000023343;弱仔性状有1个SNP达潜在显著关联,候选基因包括KRTAP7–1和TIAM1;经基因功能分析推测,PIK3C3、MAP3K3可能是影响猪总产仔数的候选基因。     

基于SNP芯片的云南玉米自交系遗传多样性和群体遗传结构分析

[目的]对107个云南玉米自交系进行遗传多样性和群体遗传结构分析,为云南省玉米种质创新、遗传改良、品种管理等提供理论依据,也为今后深入挖掘优良性状相关基因打下基础.[方法]以云南当地推广的107个优良玉米自交系为供试材料,以45个我国常用玉米骨干自交系作为杂种优势群划分的参照,在Axiom?Maize56K SNP Array平台上利用玉米SNP芯片(56K)进行玉米全基因组扫描,并使用Treebest的NJ-tree模型构建系统发育进化树,利用GCTA(全基因组复杂性状分析)工具进行主成分分析,揭示其遗传多样性与群体遗传结构.[结果]从107个云南玉米自交系中检出5533个均匀分布的高质量SNP分子标记位点.基于这些SNP分子标记位点分析结果可知,107个云南玉米自交系的Nei's基因多样性指数(H)为0.2981~0.5000,平均为0.4832;多态信息含量(PIC)为0.2536~0.3750,平均为0.3662;最小等位基因频率为0.5000~0.8178,平均为0.5744.群体遗传结构分析结果显示,K=6时△K最大即供试自交系可划分为六大类群,分别为塘四平头血缘类群、PB血缘类群、335母本血缘类群、自330和旅大红骨血缘类群及2个未知类群,无自交系划分到其他杂交优势群,其中,2个未知类群共37个云南玉米自交系,未能与我国目前已知的10个杂种优势群归在一类.主成分分析结果显示,107个云南玉米自交系与45个我国常用玉米骨干自交系能明显区分,大部分云南玉米自交系集中在我国常用玉米骨干自交系附近,但少数云南玉米自交系与我国常用玉米骨干自交系距离较远.[结论]云南地区玉米种质资源遗传多样性较丰富,含有多个杂种优势群,育种亲本遗传基础丰富,与我国常用玉米骨干自交系能明显区分,且部分与骨干自交系遗传距离较远,可创建新的杂交优势群,具有良好的应用潜力.     

中外猪种CRYAB基因的SNP分析

采用RT-PCR的方法对蓝塘猪、大花白猪、杜洛克猪、大白猪、长白猪5个中外猪种CRYAB基因的4个SNP进行分型,统计了各SNP的基因型频率和基因频率.结果表明,4个SNP位点在不同猪种中的基因型频率和基因频率具有不同程度的差异,其中308、1663位点SNP在蓝塘、大花白这2个中国地方猪种中,基因频率呈现极端分布,为猪CRYAB基因功能的进一步研究提供理论基础.     

猪PLIN1基因单核苷酸多态检测与遗传分析

以皖南黑猪、安庆六白猪、圩猪和霍寿黑猪共236头猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测猪脂滴包被蛋白（Perilipin, PLIN1）基因的遗传多态性。结果表明,在皖南黑猪、安庆六白猪PLIN1基因3 519 bp碱基处发生A>G突变,检测到AA、AB、BB 3种基因型, 其中AA基因型频率在这2个群体中分别为8.97%和29.23%,AB基因型频率分别为43.59%和56.92%,BB基因型频率分别为47.44% 和13.85%;皖南黑猪、安庆六白猪的多态信息含量（PIC）分别为0.3353和0.3690,在该位点均处于中度多态;卡方检验表明皖南黑猪群体和安庆六白猪群体均处于哈迪-温伯格平衡状态(P>0.05);在圩猪、霍寿黑猪群体中PLIN1基因的第2外显子没有检测到突变。PLIN1基因的第3外显子在4个群体中均没有检测到突变。     

皖南黑猪CETP基因单核苷酸多态检测与遗传分析

以 112头皖南黑猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测胆固醇酯转运蛋白（cholesteryl ester transfer protein,CETP）基因的多态性。结果表明：(1) 皖南黑猪CETP基因第1内含子795碱基处发生C→T突变（C795T）;(2) 在C795T突变位点中检测到CC、CT、TT 3种基因型,其基因型频率分别为0.6250、0.3036和0.0714;C的基因频率为0.7768,T的基因频率为0.2232;(3) 皖南黑猪CETP基因的多态信息含量（PIC）为0.2866,该位点处于中度多态;卡方检验表明,该位点的χ²值为1.7388,处于哈迪-温伯格平衡状态。     

牛MyoG基因单核苷酸多态性分析

以皖东牛和广丰牛共128头牛为研究对象,采用PCR-RFLP方法检测牛MyoG基因的多态性。结果表明,在牛MyoG基因的外显子466碱基处发生G>C突变,检测到AA和AB 2种基因型,该位点的突变未引起氨基酸序列的变化。在皖东牛群体中AA基因型频率为23.66%,AB基因型频率为76.34%;在广丰牛群体中AA基因型频率为17.24%,AB基因型频率为82.76%。皖东牛的多态信息含量（PIC）为0.3606,广丰牛为0.3702,在该位点均处于中度多态。卡方检验表明皖东牛群体处于哈代-温伯格不平衡状态(P<0. 05);广丰牛处于哈代-温伯格平衡状态(P>0. 05)。     

基于柿雌雄花芽转录组测序的SSR和SNP多态性分析

为深入开发柿SSR和SNP分子标记,进而推动柿品种鉴定和遗传多样性等研究,以‘禅寺丸’柿的雌雄花芽转录组序列为基础,对SSR和SNP位点进行发掘。结果表明:转录组测序获得了154 741条unigene,其中有38.49%unigene在数据库中得到注释。利用MISA软件进行SSR位点的搜索,共得到44 304个SSR,包含83种重复基元,其中以A/T类型为主的单核苷酸重复所占的比例最高(20 006个,占47.63%),其次是以AG/CT类型为主的二核苷酸重复(16 055个,占38.23%),再次是以AAG/CTT类型为主的三核苷酸重复(5 402个,占12.87%)和以AAAG/CTTT类型为主的四核苷酸重复(500个,占1.19%)。在转录组得到的unigene中共发现SNP 405 685个,发生频率为1/253bp。6种单核苷酸变异中,转换类型发生频率显著高于颠换类型,转换类型中的C/T(31.51%)和A/G(31.41%)发生频率最高,在颠换类型中A/T发生频率最高。柿SSR和SNP的位点是非常丰富的,可为柿遗传图谱构建、遗传多样性和亲缘关系研究提供丰富的基础数据信息。     

猪HGD基因第14外显子单核苷酸多态性与胴体和肉质性状的关系

【目的】研究猪HGD基因第14外显子单核苷酸多态性对猪胴体和肉质性状的遗传效应。【方法】以金华×皮特兰资源家系F2代猪为研究材料,用PCR-SSCP方法检测猪HGD基因第14外显子的多态片段,并分析了猪HGD基因型间胴体和肉质性状的差异。【结果】发现了3种基因型(CC、CT和TT)。对纯合子个体测序检测发现,在猪HGD基因第14外显子序列EF011080 143 bp处存在C→T的单核苷酸变异,这一变异导致相应的蛋白质序列中脯氨酸(Pro)到丝氨酸(Ser)的替换。在试验猪群中,等位基因C的频率比等位基因T高,为78.3%;CC基因型个体占多数,达67.3%;适合性χ2检验表明,该座位在金华×皮特兰资源家系F2代猪群体中处于非遗传平衡状态。CT基因型猪腿臀重分别较CC和TT基因型猪高0.33和0.45 kg(P<0.05);CT基因型猪臀背膘厚、眼肌面积、肌肉粗蛋白含量和眼肌电导率分别较CC基因型猪高0.31 cm,3.29 cm2,0.73%和1.38(P<0.05);CT基因型猪的眼肌pH45、腿臀肌肉pH45和腿臀肌温度分别较CC基因型猪低0.26,0.23和1.21℃(P<0.05)。【结论】HGD基因可能是影响猪胴体、肉质性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因。     

4个牛群体MSTN基因第1外显子单核苷酸多态性分析

以肌生成抑制素(MSTN)为候选基因,采用PCR-SSCP技术检测了该基因第一外显子在皖东牛、皖南牛、和牛和西门塔尔牛4个群体中的多态性。通过SNP检测,发现MSTN基因外显子1的267碱基发生A→G的同义突变,在所检测牛群中存在3种基因型(AA、GG、AG),A等位基因为优势基因。该位点在4个牛群体中均处于中度多态。卡方检验表明皖东牛、皖南牛和和牛处于哈代-温伯格平衡状态(P0.05),西门塔尔牛处于哈代-温伯格不平衡状态(P0.05)。     

策勒黑羊GDF9和BMP15基因多态性与产羔数关联分析

为了鉴定策勒黑羊BMP15和GDF9中的多态位点,并与产羔数性状进行关联分析,对相同饲养条件下81只具有产羔记录的策勒黑羊BMP15和GDF9基因完整ORF区进行测序。结果显示,在两个重要候选基因中共存在16个多态位点。GDF9基因有7个SNPs（分别为g.41769976G＞A、g.41769833G＞A、g.41769898G＞A、g.41769246A＞G、g.41769008T＞C、g.41769002A＞G）和g.41769723 TCAA缺失,其中：g.41769833G＞A 位点AA型比GG型平均多0.22只（P＜0.05）,其余6个突变位点均与产羔数不存在显著相关（P＞0.05）。BMP15基因存在9个突变位点：g.50986052C＞A、g.50985229A＞G、g.50985162T＞C、g.50985071C＞T、g.50983056C＞G、g.50982538T＞C、g.50981129A＞G、g.50980656T＞C和g.50981170T＞A,且这9个SNP位点与产羔数均不存在显著相关（P＞0.05）。结果可为策勒黑羊种群的保种育种提供理论参考。     

部分鸡种Brd2基因SNP和INDEL分析

Brd2(bromodomain containing protein 2)基因位于MHC(major histocompatibility complex)基因家族中,探究不同鸡种Brd2基因的SNP和Indel位点具有重要意义。试验选取我国26个优良的地方鸡种,对Brd2基因进行目标捕获测序,以NCBI中原鸡(Gallus gallus)的Brd2基因序列为参照,筛选出Brd2基因外显子和内含子中的SNP和Indel以及氨基酸的改变位点,最后制作进化树。在26个鸡种中,Brd2基因的外显子筛选出25个SNP位点,没有检测到Indel位点;内含子筛选出30个Indel位点,没有筛选出SNP位点;外显子中氨基酸仅有4个发生错义突变,其余均发生同义突变。从进化树看出,26个鸡种分为3大类:安卡鸡、雪山草鸡、文昌鸡、北京油鸡和萧山鸡类聚在一起;泰和乌骨鸡、SPF-来航鸡、河南斗鸡和广西黄鸡类聚在一起;剩余的鸡种类聚在一起,但同源性相对较低。在我国优质鸡种中Brd2基因具有一定的保守性,不同鸡种同源性较低。     

小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%, cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.