猪PLIN1基因单核苷酸多态检测与遗传分析

以皖南黑猪、安庆六白猪、圩猪和霍寿黑猪共236头猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测猪脂滴包被蛋白(Perilipin,PLIN1)基因的遗传多态性。结果表明,在皖南黑猪、安庆六白猪PLIN1基因3 519 bp碱基处发生A>G突变,检测到AA、AB、BB 3种基因型,其中AA基因型频率在这2个群体中分别为8.97%和29.23%,AB基因型频率分别为43.59%和56.92%,BB基因型频率分别为47.44%和13.85%;皖南黑猪、安庆六白猪的多态信息含量(PIC)分别为0.335 3和0.369 0,在该位点均处于中度多态;卡方检验表明皖南黑猪群体和安庆六白猪群体均处于哈迪-温伯格平衡状态(P>0.05);在圩猪、霍寿黑猪群体中PLIN1基因的第2外显子没有检测到突变。PLIN1基因的第3外显子在4个群体中均没有检测到突变。     

皖南黑猪CETP基因单核苷酸多态检测与遗传分析

以 112头皖南黑猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测胆固醇酯转运蛋白（cholesteryl ester transfer protein,CETP）基因的多态性。结果表明：(1) 皖南黑猪CETP基因第1内含子795碱基处发生C→T突变（C795T）;(2) 在C795T突变位点中检测到CC、CT、TT 3种基因型,其基因型频率分别为0.6250、0.3036和0.0714;C的基因频率为0.7768,T的基因频率为0.2232;(3) 皖南黑猪CETP基因的多态信息含量（PIC）为0.2866,该位点处于中度多态;卡方检验表明,该位点的χ²值为1.7388,处于哈迪-温伯格平衡状态。     

3个安徽地方猪品种TAP1基因编码区遗传多态性分析

以3个安徽地方猪品种皖南黑猪、圩猪和霍寿黑猪共324头猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测猪TAP1基因编码区的遗传多态性。结果表明,在皖南黑猪、圩猪和霍寿黑猪TAP1基因的第10外显子41 bp碱基处发生G>A突变,检测到AA、GA、GG 3种基因型,其中AA基因型频率在这3个群体中分别为59.53%、41.27%和54.91%,为优势基因型;皖南黑猪、圩猪和霍寿黑猪的多态信息含量（PIC）分别为0.2991、0.3611和0.3242,在该位点均处于中度多态。卡方检验表明,皖南黑猪、圩猪和霍寿黑猪群体均处于哈迪-温伯格平衡状态(P>0.05)。     

牛MyoG基因单核苷酸多态性分析

以皖东牛和广丰牛共128头牛为研究对象,采用PCR-RFLP方法检测牛MyoG基因的多态性。结果表明,在牛MyoG基因的外显子466碱基处发生G>C突变,检测到AA和AB 2种基因型,该位点的突变未引起氨基酸序列的变化。在皖东牛群体中AA基因型频率为23.66%,AB基因型频率为76.34%;在广丰牛群体中AA基因型频率为17.24%,AB基因型频率为82.76%。皖东牛的多态信息含量（PIC）为0.3606,广丰牛为0.3702,在该位点均处于中度多态。卡方检验表明皖东牛群体处于哈代-温伯格不平衡状态(P<0. 05);广丰牛处于哈代-温伯格平衡状态(P>0. 05)。     

猪Mx1基因5’内含子1及外显子2单核苷酸多态性分析

通过构建DNA池和测序的方法,分析了蓝塘猪和长白猪Mx1基因5’外显子1和内含子2共计1 514 bp(2 218～3 731)单核苷酸多态性.结果表明:在1 514 bp的序列上共发现了8处单核苷酸突变,1处为颠换,7处为转换,依次是:2 593G＞A、2 740T＞C、2 792C＞T、2 855C＞T、2 962C＞A、3 004C＞T、3 669T＞C、3 690A＞G.生物信息学预测发现猪Mx1基因内含子2上也存在多个转录因子结合位点,其中2 740T＞C和3004C＞T分别位于潜在的转录因子LEF1和AP1的结合位点,但是没有位于结合位点的核心序列.     

皖南黑猪CETP基因单核苷酸多态检测与遗传分析

以112头皖南黑猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测胆固醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)基因的多态性。结果表明:(1)皖南黑猪CETP基因第1内含子795碱基处发生C→T突变(C795T);(2)在C795T突变位点中检测到CC、CT、TT 3种基因型,其基因型频率分别为0.625 0、0.303 6和0.071 4;C的基因频率为0.776 8,T的基因频率为0.223 2;(3)皖南黑猪CETP基因的多态信息含量(PIC)为0.286 6,该位点处于中度多态;卡方检验表明,该位点的χ2值为1.738 8,处于哈迪-温伯格平衡状态。     

去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律研究

【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,1.5~≤3.0mm,3.0~≤5.0mm,5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最低,在其余卵泡中表达量较高。SIRT1mRNA及其蛋白在不同直径的卵泡中表达趋势一致,在直径1.5~≤3.0mm卵泡中的表达量极显著高于其他直径卵泡(P0.01)。【结论】SIRT1基因在不同卵泡中的表达具有规律性,与猪卵巢卵泡发育具有潜在的相关性。     

猪NR4A1基因的克隆、序列分析及表达模式研究

【目的】克隆猪核受体4A1(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 1,NR4A1)DNA序列全长,并对CDS序列及其表达模式进行分析。【方法】以未成年长大母猪的卵巢为材料,采用电子克隆技术,对猪NR4A1DNA序列进行分离和测序,并对猪NR4A1基因序列进行生物信息学分析;利用性腺激素(人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)和孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG))处理卵巢颗粒细胞,采用RT-PCR方法分析猪NR4A1基因的表达模式。【结果】获得猪NR4A1基因4 870bp的DNA序列,其中CDS全长序列为1 734bp,共编码572个氨基酸;猪NR4A1基因编码的氨基酸序列与人的对应氨基酸序列的相似性最高(97%),其次为小鼠(94%);Expasy软件预测结果表明,NR4A1蛋白的氨基酸序列非常保守,其中包含2个锌指特征(NR C4-type),一个是激素受体超家族,另一个是Zf-C4超家族;猪卵巢颗粒细胞在性腺激素处理后,可诱导猪NR4A1基因在卵泡发育和排卵时期瞬时表达。【结论】猪NR4A1基因的CDS区在物种间保守性较强,推测猪NR4A1基因调节卵泡的发育和排卵过程。     

BMP7基因单核苷酸多态性与猪繁殖性状的关联分析

为探讨 BMP7基因遗传变异对杜洛克猪、豫南黑猪繁殖性状的影响。采用PCR RFLP方法检测猪 BMP7基因在杜洛克猪和豫南黑猪中的多态性分布,并分析位点基因型与猪繁殖性能的关联。检测结果表明,杜洛克猪和豫南黑猪群体 BMP7外显子2上T98C和T143C均由碱基T突变为C,属同义突变。多态位点均以A 为优势等位基因,T98C位点AA基因型占总基因型的50.5%,优于AB基因型（38.1%）与BB基因型（11.4%）（呈AA>AB>BB趋势）。该位点AA型个体的总产仔数、产活仔数、出生窝质量、21日龄窝质量显著高于AB型（P<0.05）;T143C位点AA基因型占总基因型的38.8%,优于AB基因型（38.0%）与BB基因型（23.1%）（呈AA>AB>BB趋势）。该位点不同基因型个体的总产仔数,产活仔数和初生质量在不同基因型之间均差异显著（P<0.05）。研究结果说明, BMP7基因多态位点与母猪繁殖性能显著相关,可以用于猪分子遗传育种的候选基因。     

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

目的 将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。方法 分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1 μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3 μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。结果 建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLV-sgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。结论 利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。     

猪DECR1基因SNPs筛选及其多态性分析

以大白猪、长白猪和杜洛克3个猪种共327头为试验材料,对2,4-dienoyl-CoA reductase 1(DECR1)基因第6至第10外显子区域进行SNPs筛选,分析SNP突变位点的遗传多态性;采用比较基因组方法,根据人DECR1基因全长序列设计引物,筛选猪DECR1基因的SNP,经PCR-SSCP技术和测序检测...     

德化黑鸡黑素皮质素受体1（MC1R）基因单核苷酸多态性分析

采用聚合酶链式反应及单链构象多态(PCR-SSCP)技术以及DNA直接测序的方法,对德化黑鸡MC1R基因编码区进行单核苷酸多态性(SNPs)分析。结果表明:引物P2扩增片段具有多态性,并表现为AA、AB和BB等3种基因型;经序列分析发现,BB型存在2个突变位点:分别在1094处(G-A)和1095处(T-C),其中在1095处的突变还导致氨基酸的改变(Cys-Arg)。由基因型分布情况表明,德化黑鸡C系(乌色)和D系(非乌色)均以AA型为主;BB型(含SNP)仅存在于C系中,而在D系中未发现,推测BB型可能是乌色性状特有或与乌色性状相关。     

尾叶桉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、表达与单核苷酸多态性分析

【目的】通过获得尾叶桉Eucalyptus urophylla苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因序列,分析其在不同水肥处理下的表达模式及在尾叶桉群体中的单核苷酸多态性(SNP),为研究该基因与尾叶桉抗逆性的相关性提供基础。【方法】根据巨桉E.grandis的PAL基因序列设计引物,通过基因克隆、测序获得尾叶桉PAL基因序列;采用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析该基因在不同水肥处理下的表达模式。【结果】PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422和1 750 bp)和1 759 bp的内含子区域。PAL基因在AT4处理中表达量最高,在AT5处理中表达量最低。尾叶桉PAL基因与巨桉具有高度相似性。尾叶桉PAL基因的SNP位点主要集中在内含子区域,可见尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着稳定的遗传。【结论】获得尾叶桉PAL基因全长4 507 bp,该基因具有遗传稳定性,且可能在尾叶桉抗逆性中起重要作用。     

猪CACNA2D1基因定位及与相关遗传图谱的整合分析

【目的】定位猪CACNA2D1基因并分析该基因是否可作为影响猪某些生产性状的候选基因。【方法】扩增并测定猪CACNA2D1基因的部分序列,运用辐射杂种细胞系对其进行定位并将定位结果与相关遗传图谱进行整合分析。【结果】将猪CACNA2D1基因定位在猪9号染色体79.3~86.7 cM的位置上,发现在CACNA2D1基因定位区域有3个分别影响母猪发情期排卵数、胴体肩胛重以及10周龄体重的QTL,在定位区域附近有影响猪屠宰24 h后肌肉pH值的QTL。【结论】猪CACNA2D1基因可作为猪繁殖性状、胴体性状、生长性状甚至肉质性状的候选基因进行进一步的研究。     

荷斯坦奶牛HSP70-A8基因多态性及其与DHI测定性能的关联分析

以319头荷斯坦奶牛为材料,采用PCR-SSCP方法检测牛群HSP70-A8基因的多态性,并对其与DHI测定性能进行关联分析。结果表明,在荷斯坦奶牛HSP70-A8基因的第1外显子1522 bp处发生GC突变,检测到AA、AB和BB 3种基因型,其中AA基因型频率为38.56%,AB基因型频率为31.03%,BB基因型频率为30.41%;多态信息含量(PIC)为0.3733,在该位点均处于中度多态;卡方检验表明该荷斯坦奶牛群体处于哈迪-温伯格非平衡状态;群体HSP70-A8的第2至8外显子都没有检测到多态。关联分析结果表明,BB基因型荷斯坦奶牛个体总产奶量、标准乳总产奶量、305 d标准乳产量、305 d乳脂产量、305 d乳蛋白产量、总乳脂产量和总乳蛋白产量皆极显著高于AA型个体和AB型个体(P0.01),AA基因型个体体细胞数极显著低于AB型个体和BB型个体(P0.01)。因此,HSP70-A8基因第1外显子该位点的多态性可以作为奶牛生产性能选择的候选分子遗传标记。     

猪HGD基因第14外显子单核苷酸多态性与胴体和肉质性状的关系

【目的】研究猪HGD基因第14外显子单核苷酸多态性对猪胴体和肉质性状的遗传效应。【方法】以金华×皮特兰资源家系F2代猪为研究材料,用PCR-SSCP方法检测猪HGD基因第14外显子的多态片段,并分析了猪HGD基因型间胴体和肉质性状的差异。【结果】发现了3种基因型(CC、CT和TT)。对纯合子个体测序检测发现,在猪HGD基因第14外显子序列EF011080 143 bp处存在C→T的单核苷酸变异,这一变异导致相应的蛋白质序列中脯氨酸(Pro)到丝氨酸(Ser)的替换。在试验猪群中,等位基因C的频率比等位基因T高,为78.3%;CC基因型个体占多数,达67.3%;适合性χ2检验表明,该座位在金华×皮特兰资源家系F2代猪群体中处于非遗传平衡状态。CT基因型猪腿臀重分别较CC和TT基因型猪高0.33和0.45 kg(P<0.05);CT基因型猪臀背膘厚、眼肌面积、肌肉粗蛋白含量和眼肌电导率分别较CC基因型猪高0.31 cm,3.29 cm2,0.73%和1.38(P<0.05);CT基因型猪的眼肌pH45、腿臀肌肉pH45和腿臀肌温度分别较CC基因型猪低0.26,0.23和1.21℃(P<0.05)。【结论】HGD基因可能是影响猪胴体、肉质性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因。     

关岭牛TBC1D7基因单核苷酸多态性筛查及生物信息学分析

为探究关岭牛TBC1D7(TBC1 domain family,member 7)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism sites,SNPs)对其生长性状的影响。以贵州关岭牛为试验对象,构建DNA混合池,采用PCR扩增后直接测序法对关岭牛TBC1D7基因进行SNPs检测,并对其进行生物信息学分析。结果显示:关岭牛TBC1D7基因蛋白质编码区(CDS)全长882 bp,编码氨基酸293个,形成了一种不稳定的可溶性蛋白。该蛋白中不存在跨膜区域且不存在信号肽,为非分泌蛋白。蛋白中存在6个潜在的N-糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;在关岭牛TBC1D7基因CDS区共发现了4个同义突变位点,分别为c.402T>C、c.414A>G、c.609C>T和c.648T>C。4个突变位点均导致关岭牛TBC1D7基因mRNA二级结构、自由能和基因频率发生变化。本实验筛查到关岭牛TBC1D7基因4个SNPs位点,表明关岭牛TBC1D7基因多态性丰富,为进一步研究TBC1D7基因变异和关岭牛生长发育性状的相关性提供理论基础。     

霍寿黑猪和长白猪TLR4基因第3外显子的SNP检测及其遗传差异分析

为了对安徽地方猪霍寿黑猪和引进猪种长白猪TLR4 基因进行多态性分析,采用PCR-SSCP结合PCR产物双向测序的方法研究了86头霍寿黑猪及44头长白猪2个群体共130个样本TLR4 基因外显子3部分片段的单核苷核多态性,并对检测到的突变位点进行群体遗传学分析。结果检测到1个突变C1027A,C1027A突变为错义突变。群体遗传学分析表明,该多态位点基因型的分布在霍寿黑猪和长白猪2个中外猪种间存在极显著差异(P<0.01)。C1027A位点多态性在地方猪品种和引进品种间的差异,是否与品种抗病性有关,值得进一步研究。