奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10^-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL.     

牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立

利用套式PCR技术建立一种快速检测牛传染病鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)并能区分野毒株和gB基因缺失疫苗的方法。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gB和gE基因序列,应用pri mer5.0软件设计了gB/BN和gE/EN的2套套式PCR引物,分别对IBRV标准株进行PCR扩增,结果表明,这2套引物均能扩增出与设计目的片段大小一致的特异性条带;用此引物对同属的伪狂犬病毒、马立克氏病毒、鸭瘟病毒进行扩增,具有良好的特异性。引物gB/BN和gE/EN的检测灵敏度分别为0.01TCID50和0.1TCID50。     

牛传染性鼻气管炎

<正>牛传染性鼻气管炎是由牛传染性鼻气管炎病毒引起牛的一种急性接触性传染病。又称牛疱疹病毒I型感染、红鼻病或牛传染性坏死性鼻炎。临床特征为呼吸困难和发热,有鼻炎、鼻窦炎、喉炎和气管炎。1病毒牛传染性鼻气管炎病毒又称牛疱疹病毒I型(BHV-1),属于疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科成员。病毒在pH6.9～9.0时稳定,在pH4.5～5.0下可被灭活。病毒在4℃可保存1个月,37℃存活10天左右,多种消毒剂均可使病毒灭活,如0.5%氢氧化钠、0.01%氯化汞、1%漂白粉、1%酚     

牛传染性鼻气管炎的流行与防治

牛传染性鼻气管炎(又称为牛疱疹病毒Ⅰ型感染症,牛传染性坏死性鼻炎,红鼻子病,牛交媾疫,传染性脓疱外阴道炎)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起牛的一种急性、热性、接触性传染病,以高热、     

牛传染性鼻气管炎的流行与防治

牛传染性鼻气管炎(又称为牛疱疹病毒Ⅰ型感染症,牛传染性坏死性鼻炎,"红鼻子"病,牛交媾疫,传染性脓疱外阴道炎)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起牛的一种急性、热性、接触性传染病,以高热、     

猫疱疹病毒1型PCR检测方法的建立

为建立一种猫疱疹病毒1型的PCR检测方法,根据猫疱疹病毒1型的gD基因序列设计了1对特异性引物,以猫三联疫苗为模板,扩增出1125bp的目的基因片段,该产物序列与GenBank上公布的基因序列同源性为100%。特异性和敏感性试验表明,该方法对犬三联疫苗、猪伪狂犬病弱毒苗均无交叉性反应;并且最小可检出含有103个拷贝的样品。使用此PCR方法与间接免疫荧光分别对30个临床样品进行了检测,表明其可从24个间接免疫荧光检测阳性样品中检出23个阳性,符合率为95.8%。本研究初步建立了快速检测猫疱疹病毒1型的PCR方法,为猫传染性鼻气管炎的检验检疫及临床早期诊断奠定了基础。     

新疆南疆某规模牛场牛传染性鼻气管炎PCR鉴定与分析

本试验对15份疑似感染牛传染性鼻气管炎(IBR)患牛鼻腔分泌物样品提取病毒DNA,以gB基因特异性引物进行PCR扩增,测序、核苷酸同源性分析。结果显示,在15个样品中检测出3个牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)核酸阳性样本,检出率为20%,其中1个样本提交GenBank(KY348790),命名为IBRV-4T3-1,3个IBRV核酸阳性样本之间核苷酸同源性达到99%以上,而与IBRV参考株gB基因核苷酸同源性为88.8%以上,构建的gB基因遗传进化树表明,IBRV-4T3-1与参考株亲缘关系较近,处于遗传进化树中同一分支上,属于α疱疹病毒亚科水痘病毒属(Varicellovirus)牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)。结合发病情况、临床症状,确认疑似患牛感染IBRV。     

新疆阿克苏地区牛传染性鼻气管炎病毒与牛副流感病毒3型感染的检测

为调查阿克苏地区是否存在牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)与牛副流感病毒3型(BPIV-3)的感染,从阿克苏两个规模化奶牛场采集1月龄以内可疑发病犊牛鼻液样品18份,采用双抗体夹心ELISA方法检测两种病毒的抗原,PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒gD基因,RT-PCR方法检测牛副流感病毒3型的gM基因。结果表明,ELISA方法检测IBRV和BPIV-3的感染率分别为22.22%和0%;PCR方法检测IBRV的感染率为72.22%;RT-PCR检测BPIV-3的感染率为44.44%;同时患有两种病毒的检出率为22.22%。说明在阿克苏地区存在IBRV与BPIV-3的感染,且存在两种病毒的双重感染。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达

构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-gD,转化到BL21(DE)中,通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后,免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

利用巢式PCR快速鉴定牛传染性鼻气管炎

为了快速检测牛传染性鼻气管炎,采用SDS-蛋白酶K法,提取病毒模板DNA。根据IBRV gB基因序列设计了1对特异引物,在其上下游引物的内侧又分别设计了1对引物,以这4条引物对IBRV模板进行扩增。结果成功扩增出预期目的片段,建立了巢式PCR检测方法。敏感性、特异性等检测试验结果表明该方法能特异检测IBR病毒。本方法具有快速、灵敏、特异的优点,适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定。     

BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立

参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件为94℃30s,56.2℃30s,72℃1min,循环30次;72℃延伸5min,16℃10min;BVDV引物浓度为1.0μmol/L,BPIV-3引物浓度为0.5μmol/L。采用该方法检测BPIV-3和BVDV参考病毒株,能同时扩增出预期为425bp和294bp大小的特异性片段,而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯度稀释检测,结果证明该方法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3 TCID50/0.1mL,而BVDV的灵敏度达102 TCID50/0.1mL。     

牛副流感病毒3型RT—PCR检测方法的建立

参照GenBank中公布的牛副流感病毒3型（Bovineparainfluenzavirus3,BPIV-3）全基因序列,针对BPIV-3特异性NP蛋白保守基因设计一对引物,建立了BPIV-3的RT—PCR诊断方法。其最佳扩增退火温度为58．1℃,引物浓度为1．0μmol／L。采用该方法扩增BPIV-3参考病毒．能扩增出425bp预期大小的特异性片段,而扩增牛病毒性腹泻／黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、大肠埃希氏菌、牛巴氏杆菌和沙门氏菌等常见病毒和细菌均呈阴性结果。对参考病毒进行梯度稀释检测,结果证明该法检测BPIV-3的灵敏度可达10^-3FCID50／0．1mL。     

牛病毒性腹泻二温式PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5’端非编码区设计了1对可以扩增244bp BVDV某段基因序列的特异性引物,优化建立了BVD的二温式PCR快速检测方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;最低能检测到1pg牛病毒性腹泻病毒RNA。本研究所建立的BVD二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。     

应用鳗鲡肾脏细胞分离疱疹病毒及毒株理化性质试验

为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AnHV)毒株的理化性质,用鳗鲡肾脏细胞(European eel kidney cell,EEK)从福建省某鳗鲡养殖场出现"脱黏败血病"典型症状的欧洲鳗鲡组织中分离得到一株病毒株,采用电镜观察、PCR检测和DNA测序对其进行鉴定,并对分离毒株进行温度和酸...     

Establishment of a Duplex TaqMan Real-time PCR Method for Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus Types 1 and 2

【Objective】 This study was aimed to establish a duplex TaqMan Real-time PCR method for rapid detection of Bovine viral diarrhea virus types 1(BVDV1) and 2(BVDV2).【Method】 Specific primers were designed based on the 5'-non-coding region of 95 strains of BVDV1 and BVDV2 in GenBank.The positive plasmids containing the target fragments of BVDV1 and BVDV2 were constructed.The reaction conditions were optimized, the standard curve was constructed, the specificity, sensitivity and reproducibility of the duplex TaqMan Real-time PCR method were tested, and the established duplex TaqMan Real-time PCR assay was used to detect the clinical samples collected from Jilin province.【Result】 The results showed that the optimal annealing temperature of the duplex TaqMan Real-time PCR was 57.0 ℃, the optimum primer concentration was 0.5 μmol/L, and the optimum probe concentration was 0.3 μmol/L.The standard curves of BVDV1 and BVDV2 were Y=-3.54X+37.36 (R²=0.990) and Y=-3.18X+35.95 (R²=0.997), respectively.There was no specific amplification of Infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV), Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) and Bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3), with intra- and inter-batch CV less than 3%, and the lower limit of detection was 10 copies/μL.The results of clinical samples showed that the overall positive rate was 23.1% (36/156), of which 17.9% (28/156) were positive for BVDV1 and 5.1% (8/156) were positive for BVDV2.【Conclusion】 In this study, a duplex TaqMan Real-time PCR method was established, which could identify BVDV types 1 and 2 simultaneously, quickly and accurately, and provided technical support for the prevention, control and purification of BVDV.     

多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因

根据对已报道的PCR检测方法灵敏性评价,以常用KHV病毒PCR检测的目的基因KHVSphI片段(AY568590)、KHV5/9(AF411803)和KHVTK基因(AJ535112)作为靶基因,设计并选择3对特异性引物建立的多重PCR检测体系用于KHV病毒多基因的检测。本研究建立的多重PCR体系具有较高的特异性,能够特异性扩增出KHVSphI片段290bp、KHV5/9片段484bp和KHVTK基因片段409bp,对锦鲤和鲤鱼的另外一种病毒性病原鲤春毒血症病毒检测结果为阴性。多重KHV病毒PCR体系检测KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段单一模板的检测下限分别为:10fg、100fg和100fg,在相同模板浓度的情况下,KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段同时被检出的检测下限为100fg。对KHV病毒感染组织的检测结果表明,多重KHV病毒PCR检测结果与常规PCR检测结果基本吻合,在多重PCR检测体系中KHVTK基因片段检测的灵敏度高于检验检疫行业标准方法。结果表明,多重KHV病毒PCR检测方法能够快速、准确和灵敏地检测KHV病毒基因。     

A polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of bovine herpesvirus 1 (BHV1) in selectively digested whole bovine semen

A PCR assay for the detection of bovine herpesvirus type 1 (BHV1) DNA in selectively digested whole bovine semen was developed and evaluated. A brief treatment with proteinase-K was used to lyse free virus, virus present in non-sperm cells and virus adhering to the spermatozoa. Genomic bovine DNA was not released by this treatment. Primers and probes were based on the nucleotide sequence of the gD gene. BHV1 virus-spiked split samples were used as positive controls and the PCR products were detected by eye in ethidium bromide-stained agarose gels. Sequentially collected non-extended semen samples from experimentally infected bulls were used to compare this assay with virus isolation. Of a total of 162 ejaculates, 51 were found positive by virus isolation, whereas PCR detected BHV1 DNA in 73. PCR detected BHV1 DNA for a longer period after infection and reaction. Apart from its superior sensitivity, this PCR assay also has the advantage of being a relatively simple procedure, providing results within 24 h.Abbreviations AI artificial insemination - BHV1 bovine herpesvirus type 1 - PCR polymerase chain reaction - TCID₅₀ tissue culture infective dose, 50%