PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因重组真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)已知序列设计3对引物,采用RTPCR方法扩增PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因,目的基因依次插入真核表达载体pcDNA4.0,经PCR、酶切及测序分析,重组质粒构建成功,并命名为pcDNA4.0-ORF5-E2.重组质粒回收提纯后,以100 μg/只剂量免疫小鼠,免疫3次.三免后10 d采血并制备血清,用间接ELISA检测小鼠血清中PRRSV及CSFV抗体效价.结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生PRRSV及CSFV抗体.     

猪瘟病毒囊膜蛋白基因pcDNA4．0-E重组质粒的构建及其对小鼠的免疫原性

以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板，应用RT—PCR方法，克隆得到猪瘟病毒囊膜蛋白E0-E2 cDNA全序列，并将其与真核表达质粒pcDNA4．0定向连接，构建了重组质粒pcDNA4．0-E。经提纯后，给试验组小鼠后肢胫前肌注射pcDNA4．0-E，每只100μg，15d后再注射1次，同时设空白对照组。于二免后第10、20、30d分别扑杀小鼠，进行免疫小鼠脾和外周血淋巴细胞的转化增殖试验，并用间接ELISA法检测血清抗体水平。结果显示，与空白对照组相比，所构建的重组质粒能够极显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞的增殖（P〈0．01），血清抗体水平从二免后的第10d开始逐渐升高，且极显著高于对照组（P〈0．01）。说明该重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。     

融合表达猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因真核质粒的构建及对小鼠的免疫原性

用PCR法扩增出猪圆环病毒2型的Rep蛋白基因（933bp）和Cap蛋白基因（705bp）,将其定向克隆于真核表达载体pcDNA3.1（＋）的多克隆位点上,构建真核表达质粒pcDNA-ORF1-ORF2。将构建好的重组质粒pcD-NA-ORF1-ORF2按100μg/只腿部肌肉注射BALB/c小白鼠,同时设pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2、pcDNA3.1-（＋）、PCV2全毒疫苗和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第0、7、14、21、28、42天用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖效应,用ELISA法检测小鼠的抗体水平;并于首免后第0、7、14、21、28天测定脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例,对该核酸疫苗的免疫原性进行初步评价。结果显示,重组质粒能诱导鼠体产生较强的细胞免疫和体液免疫,并从免疫后第7天起所测各组数据均显著高于（P〈0.05）或极显著高于（P〈0.01）其他试验组。结果表明,将ORF1和ORF2基因共同用于PCV2核酸疫苗的研发具有很好的前景,为研究新型猪圆环病毒疫苗奠定了基础。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核表达质粒在小鼠的细胞免疫应答

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5.经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白.免疫SPF小鼠,检测鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平.结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫.     

猪圆环病毒2型ORF3蛋白的原核表达及抗体检测ELISA方法的建立

通过外源表达PCV2 ORF3蛋白,为ORF3蛋白的抗体制备和检测提供基础材料。根据PCV2的ORF3基因序列设计特异性引物,克隆ORF3全基因,构建重组原核表达质粒,转入大肠埃希菌进行表达,将纯化的蛋白包被ELISA板,建立ORF3抗体检测ELISA方法。结果表明,获得了重组pGEX-6p-1-ORF3原核表达质粒,最佳表达条件为37℃,225 r/min,IPTG 1.0 mmol/L诱导5 h;建立的ELISA检测方法可以检测PCV2阳性血清,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清无交叉反应。本试验为ORF3抗体制备提供了基础材料,也为PCV2抗体检测提供了可选择方法。     

猪繁殖和呼吸综合症病毒河南地方株ORF5／6基因的克隆及真核表达

应用RT-PCR方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)河南地方株的ORF5和0RF6基因。将扩增基因克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,设计不同引物自行构建重组质粒PcDNA-ORF5、ORF6和pcDNA-ORF5/6。运用磷酸钙法将重组质粒分别瞬时转染293T细胞,经流式细胞和westbloting试验分析表明共表达重组质粒PcD-NA-ORF5/6表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,而pcDNA-ORF5-ORF6在293T细胞很难检测到蛋白表达。该结果表明蛋白质生物活性和其蛋白质空间构象有一定关系,也为下一步进行构建PRRSV假型病毒来研究ORF5/6蛋白的结构与功能的关系奠定了基础。     

鼠抗猪圆环病毒2型“ORF7”多克隆抗体的制备及应用

为深入研究新鉴定的"ORF7"蛋白在猪圆环病毒2型(PCV2)感染中的作用,制备了鼠抗ORF7蛋白的多克隆抗体并进行初步应用。首先,克隆ORF7基因,分别构建了重组原核表达质粒pGEX-6p-1-ORF7和重组真核表达质粒pCDH-CMV-Flag-ORF7。将pGEX-6p-1-ORF7进行诱导表达,确定在IPTG 0.8 mmol/L、37℃下诱导12 h表达量最高,且以包涵体形式表达,分子质量大小约为44 ku。将目的蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠,第4次免疫后收集小鼠血清,ELISA方法检测其抗体效价为1∶10000,可用于免疫印迹试验检测pGEX-6p-1-ORF7表达的重组蛋白。应用获得的多克隆抗体通过IFA检测PCV2感染的PK-15细胞中ORF7蛋白的表达,Western blot检测pCDH-CMV-Flag-ORF7和pEGFP-N1-ORF2蛋白的表达,结果表明制备的多克隆抗体可用于IFA和Western blot检测ORF7蛋白。研究结果为探究ORF7在PCV2感染中的作用提供了基础材料。     

猪2型圆环病毒核酸疫苗的研制及其对小白鼠的免疫效果

为研制猪2型圆环病毒（PCV2）新型核酸疫苗，以pcDNA3为载体，与PCV2的ORF2及其高变区V1、V2、V3、V1-V2连接，分别成功构建了真核表达质粒pcDNA3-ORF2、pcDNA3-V1、pcDNA3-V2、pcDNA3-V3和pcDNA3-V1-V2。对阳性真核表达质粒大量生产并纯化后，以每只小白鼠0．2mg免疫5周龄左右的雌性小白鼠，然后用ELISA检测免疫小白鼠血清中抗体的产生情况。结果显示，这5种真核表达质粒均能刺激小白鼠产生特异性抗体，但相比之下，真核表达质粒pcDNA3-V1-V2诱导小白鼠产生的抗体水平更高，维持的时间更久。表明质粒pcDNA3-V1-V2的免疫效果较好，有望成为防制猪2型圆环病毒的候选疫苗。     

基因枪与肌肉注射猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠体液及细胞免疫的比较研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗（pcDNA—PRRSV—ORF5）以不同免疫途径（基因枪和肌肉注射）免疫BALB／c小鼠，以PBS和空载质粒pcDNA3．1（＋）为对照，采用流式细胞仪（FACS）、淋巴细胞增殖试验（MTT法）及间接ELISA试验分别对小鼠外周血中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞数、T淋巴细胞的转化功能及小鼠血清中特异性PRRSV血清抗体IgG动态变化进行了检测。结果表明，pcDNA—PRRSV-ORF5基因疫苗接种小鼠后外周血对ConA有明显的反应性，试验组与对照组比较差异极显著（P〈0．01）或显著（P〈0．05），CD4^＋T淋巴细胞数在免疫后7d高于对照组（P〈0．01），CD8^＋T淋巴细胞在免疫后28d高于对照组，不同途径基因疫苗接种小鼠后均诱导小鼠产生PRRSV特异性IgG。在诱导细胞免疫方面，基因枪和肌肉注射各组间无明显差异；在诱导体液免疫方面，基因枪法优于肌肉注射。研究表明制备的pcDNA—PRRSV—ORF5基因疫苗免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的体液和细胞免疫应答，基因枪法较肌肉注射更能诱导体液免疫应答的产生。     

PCV-2 ORF2基因的真核表达及其体内分布和安全性检测

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从广西PCV-2的DNA扩增出ORF2基因,将ORF2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )载体上,获得重组质粒,经PCR酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为ORF2目的基因,插入的位置、大小和阅码框均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-PCV-ORF2。对阳性真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2大量抽提后,以每只小鼠0.2 mg免疫5周龄左右的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况,同时进行pcDNA-PCV-ORF2的体内分布和安全性检测。结果表明,pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内广泛存在,产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7天开始产生抗体,第28天抗体水平达到最高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性。本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了猪圆环病毒的特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析

为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用本室构建的质粒PGEX-ORF2特化BL21（DE3）．经IPTG诱导表达．得到PCV2-ORF2的重组蛋白，经复性纯化后作为免疫原．采取常规免疫与体外脾脏免疫结合的方式免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与Sp2／0的骨髓瘤细胞融合．经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选，获得了2株抗PCV2-ORF2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞．分别命名为382F4和9C3132，其细胞培养上清效价分别为1：1024、1：512，小鼠暖水效价分别为1：204800、1：102400。ELISA结果显示，382F4和9C3D2仅与融合表达的PCV2-ORF2蛋白反应，而与PGEX-KG表达的蛋白、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不反应．说明此2株单抗特异性好。间接免疫荧光结果显示．382F4和9C3D2能与PCV2发生反应，而不与PCV1发生交叉反应．表明所获得的2株单抗是PCV2型特异性的。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2-ORF2基因的功能．及建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法提供了强有力的手段。     

猪圆环病毒真核表达质粒的构建及其免疫原性的初步研究

用PCR方法扩增猪圆环病毒PCVwhn株编码Cap蛋白的基因(ORF2),将ORF2插入到真核表达载体pcI)NA3.1( )中构建重组质粒pcDNA-PCV-ORF2,然后肌肉注射免疫小白鼠,通过ELISA诊断试剂盒检测小白鼠的血液中特异性抗体的变化情况.试验结果表明:小白鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第1周开始产生抗体,第4周抗体水平达到最高,抗体可维持10周以上.本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础.     

猪IL-2真核表达质粒构建及对PRRSV-ORF5基因疫苗免疫佐剂作用的研究

本研究应用真核表达载体pcDNA3.1（＋）和猪白细胞介素2（IL-2）基因成功构建了IL-2的真核表达质粒（pcDNA-IL-2）,探讨了pcDNA-IL-2作为分子免疫佐剂对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）ORF5基因疫苗（pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5）免疫猪的增强作用。经间接ELISA法、MTT比色法及流式细胞仪分别对pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪、pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪、pcDNA3.1（＋）空载体和灭菌水免疫对照猪的血清抗PRRSV抗体IgG、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4^＋和CD8^＋细胞比例进行检测,结果表明pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪的IgG含量、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4^＋和CD8^＋细胞比例与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪相比有显著差异（P〈0.05）。说明pcDNA-IL-2能显著增强pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5基因疫苗免疫猪的体液和细胞免疫应答,可作为PRRSV基因疫苗的良好佐剂。     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF2蛋白序列与其核定位功能的相关性

软件分析PCV1-ORF2的核苷酸序列发现其N端的氨基酸序列中包含一段核定位序列,将具有核定位序列特征的区域删除,构建缺失核定位序列的PCV1-ORF2基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,同时构建PCV1-ORF2全基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,分别转染Hela细胞,可观察到后者绿色荧光聚集在细胞核区域;而前者转染Hela细胞结果显示核定位现象消失,从而可以推断这一区域是CPV1-ORF2蛋白核定位的功能区.     

PRRSV ORF6及IL-18基因重组真核质粒试验免疫研究

将本实验室构建的重组质粒接种PRRSV的自然宿主断奶仔猪,分析其诱发细胞免疫和体液免疫应答的能力。结果表明：重组质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6免疫组在首免后14d开始产生特异性抗体,且其产生抗体水平随时间呈上升趋势,但pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6两组之间产生抗体差异不显著（P〉0.05）。中和抗体检测结果显示只有pEGFP-ORF6在首免后42d有低水平的中和抗体产生。细胞免疫检测结果表明,pEGFP-IL18-ORF6诱导T淋巴细胞增殖和促进IFN-γ和IL-2的分泌的能力显著高于pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18（P〈0.05）,表明IL-18有效地发挥了分子其佐剂的效用,能增强细胞免疫应答并介导较好的Th1类免疫反应。     

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列,分别设计一对引物,应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经Nhe Ⅰ／EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2,RT-PCR产物ORF5经NotⅠ／XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2／ORF5。对此质粒中的插入片段,进行PCRRT-PCR及双酶切鉴定,同时对插入序列进行测序分析,表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99％,pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型（VR-2332株）氨基酸同源性为99％。此重组表达载体的成功构建,为进一步研究PCV-2ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。     

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001～2007年分离自山东地区10株(ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析.结果表明:该10株病毒仍属北美洲型,其中2001～2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株(VR-2332株)和疫苗毒MLVRespPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006～2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ 、SD3,SD4,SD5, SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%～100%,99.4%～99.8%,99.2%～99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株(JXA1、Shanghai、HEB1)同属一个大的分支.首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势.     

表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2基因的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。