小麦耐盐相关基因TaRSTR的克隆与功能分析

高盐是限制植物生长和发育的重要非生物胁迫因子。以耐盐小麦RH8706-49根部基因表达谱芯片结果为基础,利用电子克隆和RT-PCR方法克隆了一个盐胁迫时上调表达的基因,命名为TaRSTR(登录号:EU263918)。荧光定量PCR分析证实该基因受盐胁迫诱导表达,亚细胞定位结果显示TaRSTR蛋白定位在细胞核里。TaRSTR过表达提高了转基因拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及成年植株的耐受性。TaRSTR基因过表达可显著提高已知耐盐相关基因At FRY1、At P5CS1和AtRD29B的表达量,推测TaRSTR基因通过这些标记基因提高了转基因拟南芥的耐盐性。上述结果表明TaRSTR基因过表达能提高植株的耐盐性,是植物耐盐的正调节子。     

转Mz_2NHX_1基因拟南芥对盐胁迫的生理响应

为了探讨珠美海棠Na~+/H~+逆向转运蛋白基因Mz_2NHX_1在植物耐盐中的作用,以野生型拟南芥和转Mz_2NHX_1基因拟南芥为材料,研究不同盐浓度对转基因和野生型拟南芥种子萌发、植株耐盐性相关生理指标的影响。结果表明:在不同盐胁迫下,转基因拟南芥种子发芽率明显高于野生型。随着盐浓度的增加,野生型和转基因植株的电导率呈上升趋势;SOD活性呈先上升后下降趋势;POD活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量在野生型植株中呈先上升后下降趋势,在转基因植株中呈不断升高的趋势。盐胁迫下,转基因植株的各项生理指标均优于野生型,表明Mz_2NHX_1基因的过量表达,提高了转基因拟南芥的耐盐性。     

桑树Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆及功能分析

盐害是威胁作物生长的重要因素之一,培育和种植耐盐作物品系是进行盐地开发利用的有效途径。该研究通过RACE方法,从特优1#桑品种克隆获得了Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(MaNHX)的全长cDNA(2 016 bp),编码蛋白预测分子量59.28 ku,等电点6.67,含保守位点(~(82)LFFIYLLPPI~(91))。用根癌农杆菌介导法,将MaNHX基因导入拟南芥中,结果表明,在拟南芥中异源表达MaNHX能明显提高拟南芥对盐胁迫的耐受性。转基因植株NaCl胁迫下叶绿素含量更高、抗氧化活性增强,MDA含量下降。结果证实,异源表达MaNHX转基因拟南芥可以通过维持细胞膜稳定性、减少膜损伤和透性伤害等机制应对盐胁迫。该研究可为桑树的抗盐品种培育提供候选参考基因。     

AtNHX1提高烟草耐盐性的研究

[目的]探讨利用AtNHX1基因提高烟草耐盐性的效果。[方法]利用农杆菌侵染的方法对烟草的叶盘进行遗传转化,将拟南芥的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因AtNHX1成功地转入了烟草中,对获得的28株潮霉素抗性转基因植株中的6株进行了Southern检测,并用200mmol/LNaCl对转基因植株进行盐分胁迫与耐盐性鉴定。[结果]分子检测表明,AtNHX1已经整合到烟草的基因组中,并得到了表达。在盐分胁迫下,各转基因株系具有较高的光合速率和PSⅡ活性,光合速度和Fv/Fm值均显著高于野生型对照,株系T1、T5的SOD酶活分别是野生型的1.8和2.1倍,各转基因株系GR活性也均显著高于野生型,而MDA含量则低于野生型。[结论]转At-NHX1基因的各株系的耐盐性较野生型对照有了较大程度的提高。     

过表达ApGSMT2和ApDMT2基因的拟南芥和玉米耐盐性分析

玉米是对土壤盐渍化中度敏感的作物,易受盐碱危害。甘氨酸甜菜碱作为一种主要的渗透保护物质,能够提高植物对多种非生物胁迫(如盐碱、干旱、低温等)的抗性。本工作前期从嗜盐隐杆藻中克隆得到两个参与甘氨酸甜菜碱合成的甲基转移酶基因ApGSMT2和ApDMT2,利用农杆菌介导法,将两个基因分别在拟南芥和玉米中共同过表达,获得转基因阳性株,收获T_1代转基因种子,经自交后得到T_2代种子。以拟南芥T_2代种子为试材,设置0、50、100、150、200 mmol/L NaCl处理,进行种子萌发试验,结果显示,不同盐浓度处理下,转基因拟南芥种子的萌发率显著高于未转基因对照植株,说明过表达ApGSMT2和ApDMT2基因对于提高拟南芥的耐盐性具有显著效果。进一步对T_2代转基因玉米株系幼苗的耐盐性进行试验,结果表明,180 mmol/L NaCl处理后,未转基因对照植株萎蔫,而转基因株系长势良好,其株高、根长、叶片相对含水量和鲜重显著高于对照,说明过表达ApGSMT2和ApDMT2基因显著提高了玉米对盐胁迫的耐受性,为利用基因工程技术创制玉米耐盐种质提供了理论依据。     

黄瓜氮素胁迫相关基因CsAHP1的克隆及功能分析

为研究黄瓜耐低氮素胁迫的生理与分子机制,克隆了1个黄瓜氮素胁迫相关基因CsAHP1,其cDNA全长为462 bp。序列分析表明,CsAHP1基因在不同物种中高度保守。进化树分析结果表明,CsAHP1蛋白与甜瓜的AHP蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,CsAHP1基因在低浓度氮素条件下表达量较高。功能分析结果表明,低浓度氮素胁迫条件下拟南芥Col-0植株根长明显变短,其质量也显著降低,而35S∶∶CsAHP1转基因拟南芥株系的根长缩短程度和质量下降率都显著小于Col-0植株,表明CsAHP1过表达拟南芥转基因植株表现出比Col-0植株更强的耐氮素胁迫能力。综上所述,黄瓜CsAHP1基因可以提高35S∶∶CsAHP1拟南芥过表达转基因株系的氮素胁迫能力。     

过表达番茄Sly-miR397基因增强拟南芥的耐旱性

为研究番茄miRNA在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用Real-time PCR检测番茄miRNA397在非生物逆境(干旱、盐害、ABA)条件下的表达量变化,发现Sly-miR397响应这些逆境胁迫,尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Sly-miR397过表达载体转入拟南芥中,进行转基因功能验证。结果表明:与野生型相比,转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢,保水能力更好,且在干旱胁迫下,转基因植株的长势明显优于野生型,其最大光合效率、3种抗氧化酶活性SOD、POD、CAT均明显高于野生型,同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Sly-miR397能提高拟南芥对干旱胁迫的耐受性,在植物抗旱过程中起着重要作用。     

利用转基因技术创造甜菜耐盐新种质

采用农杆菌介导法将来源于E coli的胆碱脱氢酶 (CDH)基因 (betA)和来源于拟南芥的Na+ /H+antiport基因分别转入 5个糖甜菜品种的丛生芽细胞 ,获得了转基因植株。在耐盐性筛选中 ,转基因植株存活率高 ,部分植株生长较好 ,表现出比对照植株明显提高的耐盐性。在 2 %～ 3%NaCl胁迫下 ,少数转基因植株仍生长正常 ,显示出高耐盐性。本研究表明 ,转入在不同盐胁迫反应途径中起关键作用的酶基因均可提高甜菜耐盐性 ,采用转移多个耐盐基因的策略有可能创造出高耐盐特性的新材料     

拟南芥At3g28220基因抗寒功能初步分析

采用RT-PCR分析、基因克隆、转化等方法对At3g28220基因功能进行了研究.结果发现At3g28220基因在拟南芥受到低温及盐胁迫时才会在拟南芥中表达,且在不同生长期不同器官中的表达量无明显差异.通过构建35s:At3g28220基因正反向表达载体转化拟南芥,T1植株经卡那霉素抗性筛选,RT-PCR检测,结果表明At3g28220基因已经整合到拟南芥基因组中,并在转录水平表达.正常生长条件下,转基因拟南芥与野生型拟南芥的生长未见明显区别,而经过低温胁迫研究发现,正向表达转基因拟南芥的冷冻耐受能力明显高于野生型植株.说明拟南芥hos10-1冷驯化能力的丧失是与At3g28220基因的表达下调有直接的关系.     

马铃薯StTrxF基因的克隆与功能分析

为探究马铃薯硫氧还蛋白基因(StTrxF)的耐盐生理机制,通过RT-PCR方法从马铃薯品种中薯5号中克隆得到全长549bp硫氧还蛋白基因(StTrxF)。该基因编码182个氨基酸,预测蛋白质分子量为44.17ku,理论等电点(pI)为5.23,具有典型的Thioredoxin结构域。由StTrxF基因推导的氨基酸序列与番茄、拟南芥、芝麻和赤霞珠等TrxF蛋白质氨基酸序列的同源性为96.02%～59.28%。构建植物过表达载体,导入拟南芥中,获得转基因拟南芥纯系植株。通过对转基因拟南芥植株的耐盐离体和盆栽鉴定,表明转基因植株的耐盐性显著提高。同时盐胁迫下,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量显著提高,丙二醛(MDA)含量显著降低。结果表明,表达StTtxF基因通过增加转基因植株脯氨酸含量,提高SOD活性,降低MDA含量,以维持细胞渗透平衡并激活ROS清除系统,具有提高转基因拟南芥植株耐盐性的显著效果。     

转TaCRT基因拟南芥植株表型分析及抗性鉴定

为了进一步揭示小麦钙网蛋白基因TaCRT是否参与植物对环境胁迫响应,通过根癌农杆菌GV3101介导法将该基因cDNA克隆转入拟南芥,使其异源过量表达,分析转基因拟南芥纯系和野生型植株在表型上的差异,并对转基因株系的抗盐性进行鉴定。结果表明,过表达TaCRT基因的拟南芥纯系植株在正常培养条件下,植株生长相对旺盛,根系较短,分化的不定根数目较多,而在盐胁迫条件下,与野生型相比,转基因株系的耐盐性较强。     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaAQP1 属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫。构建植物表达载体pCAMBIA1304-MaAQP1获得转基因拟南芥植株,GUS 染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部。通过Southern blot 检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验。与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力。     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaA QP1属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫.构建植物表达载体pCAMBIA 1304-MaA QP1获得转基因拟南芥植株,GUS染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部.通过Southern blot检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验.与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力.     

转DREB1A基因提高烟草抗逆性的研究

将拟南芥(Arabidopsis thatiana)DREBIA基因分别在组成型启动子花椰菜病毒35S启动子和逆境诱导型启动子rd29A的驱动下转入烟草中,获得的两种转基因植株对干早和低温胁迫的抗性均显著提高,但对盐胁迫的杭性无明显变化.研究分析了组成型启动子和逆境诱导型启动子控制的DREBIA转基因植株在形态发育和抗...     

陆地棉GhBI-1基因在拟南芥中的异位表达及耐盐性研究

前期工作中,我们从陆地棉基因组中分离了GhBI-1基因全长cDNA,构建了GhBI-1过量表达载体并转化拟南芥。本研究在此基础上,利用卡那初步筛选获得转基因拟南芥,通过PCR进一步验证,得到具有卡那抗性并且遗传稳定的T3代纯合株系。利用不同浓度NaCl处理野生型和转GhBI-1基因拟南芥,结果表明,转基因拟南芥在200 mmol/L NaCl胁迫后,萌发率和生长情况要好于野生型拟南芥,过量表达GhBI-1基因能够提高拟南芥耐受盐胁迫的能力。     

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响

目的目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。方法通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS（β-葡萄糖苷酸酶编码基因）的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。结果启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29B和P5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。结论异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29B和P5CS1的表达模式。      

根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株

 为改良草坪型高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的耐逆性，以成熟种子来源的胚性愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法将拟南芥（Arabidopsis thaliana）耐逆相关CBF1基因导入4个供试品种的基因组，经GUS染色、PCR检测和Southern杂交分析验证，获得了112株转基因植株，转化频率为0.92% ~2.87%，不同品种间存在差异。试验表明，在高盐与高渗胁迫下，转基因植株具有显著生长优势，存活率极显著高于非转化对照植株，经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率平均较对照植株低25% ~ 30%，证明转基因植株的耐逆性有所增强。考察发现，非胁迫条件下CBF1基因的组成型超表达使转基因植株的生长受到抑制。