俄罗斯落叶松原木中拟松材线虫的鉴定

宁波出入境检验检疫局植检实验室在1份来自俄罗斯的落叶松原木中截获一种伞滑刃线虫,经形态学观察、测量,PCR-RFLP图谱比对,鉴定为欧洲型拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus Mamiya et al.,1979)。从原木中截获的线虫特别细长(雌虫和雄虫a值分别为53和57),且交合刺较小(长约18μm)。经灰葡萄孢培养后,其形态特征与相关描述一致。这表明寄主和环境等因素对线虫的形态特征有较大影响,应在一致的培养环境下进行形态观察和描述,PCR-RFLP方法是伞滑刃属线虫鉴定有效的辅助手段。     

松材线虫和拟松材线虫的PCR快速检测

利用PCR技术对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus与拟松材线虫B．mucronatus的rDNA的ITS1区和5．8S区核甘酸序列扩增．根据松材线虫与拟松材线虫的ITS1序列区别,分别设计出松材线虫和拟松材线虫的特异性引物,实现了单条活的或FG(φ为4％的甲醛)固定的松材线虫和拟松材线虫的快速检测．     

宁波松木中松材线虫与拟松材线虫混生现象的报道

在对宁波地区松木中携带的伞滑刃属线虫种类进行调查时,多次发现了松材线虫与拟松材线虫混生的现象,并进行了分子生物学方法的确认。     

松材线虫和拟松材线虫食道腺及其分泌物超微结构观察

该文用透射电镜观察比较松材线虫南黑株系、拟松材线虫杭九株系幼虫期和成虫期食道腺和分泌物颗粒的形态以及在生活史中的变化. 结果表明二者的食道腺的结构以及在不同时期活性的变化是一致的:幼虫期亚腹食道腺发达,内有大量的分泌颗粒;成虫期背食道腺发达,内有大量的分泌颗粒. 松材线虫和拟松材线虫食道腺分泌颗粒可分为两种类型,这两种类型的分泌颗粒在体积和电子密度上都存在差异. 松材线虫和拟松材线虫株系间的分泌颗粒在体积上存在差异.      

松材线虫和拟松材线虫种间及种下群体的RAPD指纹分析

利用ＲＡＰＤ技术对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）和拟松材线虫（Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａ－ｔｕｓ）的分离物基因组ＤＮＡ进行了ＤＮＡ片段的随机扩增,以确定种间及种内群体的亲缘关系和筛选具有种鉴定特征的分子标记．通过对４０个１０聚体随机引物的筛选,应用８个引物对两种线虫种间及种内分离物扩增片段的遗传分析显示：两种间群体ＲＡＰＤ扩增片段的共享度为４０％～５６％,而在松材线虫的不同分离物之间的共享度为６０％～８４％;其中有一个引物（Ｐ２５３）可在松材线虫和拟松材线虫种间产生具有种鉴定特征的特异性ＲＡＰＤ片段,在松材线虫的不同分离物中均可产生一约７００ｂｐ的特异性片段,而在拟松材线虫中产生了两个分别约为１３００ｂｐ和１９００ｂｐ的特异性片段．     

拟松材线虫对马尾松致病性的研究初报

用拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)接种重庆南山马尾松(Pinus massoniana)。结果表明,对健康树无致病性,而对衰弱树的平均致死率为5.88％。     

松材线虫和拟松线虫种间及种下群体的RAPD指纹分析

利用ＲＡＰＤ技术对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｌｐｈｉｌｕｓ）和拟松材线虫（Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）的分离物基因组ＤＮＡ进行了ＤＮＡ片段的随机扩增,以确定种间及种内群体的亲缘关系和筛选具有种鉴定特征的分子标记。通过对４０个１０聚体随机引物的筛选,应用８个引物对两种线虫种间种内分离物扩增片段的遗传分析显示：两种间群体ＲＡＰＤ扩增片段的共享度为４０％￣５６％,百在松材线虫的不同分     

拟松材线虫对黑松致病性研究

松材线虫病（Ｂｕｒａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）是发生在松树上的一种毁灭性病害 ,目前已在日本、中国、美国、加拿大和韩国等分布 ,并在日本和中国造成巨大的损失。在北美洲 ,松材线虫分布也很广。针叶树中还有一些形态与松材线虫非常相近的伞滑刃线虫 ,统称松材线虫复合种（ＰＷＮＣ） ,其中最常见的是拟松材线虫。拟松材线虫在东亚、美洲、欧洲都有 ,分布极广泛。杂交试验和ＤＮＡ分析证实松材线虫和拟松材线虫有密切的关系 ,能用ＲＡＰＤ和ＲＦＬＰ技术进行区分 ,拟松材线虫的ＤＮＡ有东亚和欧洲两种类型 ,前者主要分…     

拟松材线虫媒介昆虫报道

对拟松材线虫发生区内46株萎蔫云南松上的主要蛀干害虫松墨天牛、纵坑切梢小蠹和马尾松角胫象甲进行采样、分离和镜检,结果表明:松墨天牛携带拟松材线虫,是拟松材线虫的主要媒介昆虫,纵坑切梢小蠹和马尾松角胫象甲未检出拟松材线虫.通过分析云南拟松材线虫的危害性提出防控对策.     

松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白基因全长cDNA克隆与分析

[目的]对松材线虫和拟松材线虫的14-3-3蛋白基因进行全长cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank数据库中14-3-3蛋白EST序列BXC56（登录号为FG589472）、BMCl20（登录号为FG589351）,采用RACE技术获取松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白的全长cDNA克隆Bxl4-3-3a和Bml4-3-3a,并对克隆片段序列进行分析。[结果]Bx14-3-3a全长1039bp,包含一个756bp的开放阅读框,编码蛋白含有251个氨基酸残基,包含2个14-3-3蛋白标签,编码蛋白分子量为61．43kD,等电点为4．88。Bx14-3-3a基因组结构中包含4个外显子和3个内舍子序列。Bm14-3-3a全长992bp。有与Bx14-3-3a编码完全相同的氨基酸序列。序列比对结果表明,14-3-3在真核生物间高度保守,Bx14-3-3A和Bm14-3-3A蛋白在系统进化上与线形动物门（Nematomorpha）的物种近缘关系较近,与植物线虫南方根结线虫（Meloidogyneincognita）系统发育关系上最为亲近。[结论]Bx14-3-3a和Bm14-3-3a的成功克隆,为进一步研究其功能及其调控因子对形态、致病力、繁殖力和环境适应性等方面的分子调控机制奠定了重要基础。     

利用rDNA的PCR-RFLP对伞滑刃属线虫群体的分子鉴别

应用对rDNA中ITS的PCR-RFLPs技术和方法对来自中国、日本和韩国的松树或木质包装箱中分离出来的伞滑刃属(Bursaphelenchus)6个线虫群体进行了分子鉴定.其中来自浙江镇海的松树和日本的木质包装箱中分离出的各一线虫群体被鉴定为松材线虫(B.xylophilus),而来自浙江富阳的松树和韩国、香港及日本的木质包装箱中的另一个群体等4群体被鉴定为拟松材线虫(B.mucronatus).本研究中选用的4种限制性内切酶(Hinf Ⅰ、Hae Ⅲ、MspⅠ、cfo Ⅰ)的特异性酶切位点均可以有效地鉴别松材线虫和拟松材线虫.     

不同木腐菌菌株对松材线虫繁殖的影响

测试了松生拟层孔菌(Fomitopsis pinicola)、洁丽香菇(Lentinus lepideus)、桦褶孔菌(Lenzites betulina)、黑木耳(Auricularia auricular)、硫磺菌(Laetiporus sulphureus)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、粗皮侧耳(Pleu-rotus ostreatus)、杂色云芝(Coriolus versicolor)、密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)、虎掌菌(Tremellodon gelatino-sum)、灵芝(Ganodermalucidum)、绣球菌(Sparassis crispa)和茯苓(Poriacocos)13种木腐菌的22个菌株对松材线虫繁殖的影响。结果表明,除裂褶菌以外,其他菌株都能抑制松材线虫的繁殖。松材线虫在松生拟层孔菌W10和W11菌株、硫磺菌5452和6600菌株、粗皮侧耳6221菌株、虎掌菌6320菌株、茯苓6284菌株和灵芝6501菌株菌落上完全不能存活。     

28种植物提取物对松材线虫的毒杀作用

测定了采自广东、湖南、云南和新疆的骆驼蓬等15科28种植物提取物对松材线虫的生物活性。骆驼蓬、黄文江鱼藤、紫花山毛豆、厚果鸡血藤、雷公藤、了哥王、博落回等7种植物甲醇索氏提取物杀线虫活性强烈,以1000μg／mL处理后72h,校正死亡率均在88％以上。乙醇是骆驼蓬杀线虫活性成分较合适的提取溶剂。浸渍法测定结果表明,骆驼蓬种子乙醇提取物的石油醚萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物对松材线虫毒杀活性顺序强弱依次为：正丁醇〉氯仿〉水〉石油醚萃取物,其中正丁醇萃取物处理后24h和48h,LC50分别为33．98μg／mL和10．18μg／mL。松枝水培试验结果表明,骆驼蓬种子正丁醇萃取物能明显延缓松材线虫引致的松树萎蔫病的发展,以250μg／mL处理后12d病情指数仅0．17,显著低于“清水＋虫”处理的病情指数0．75。     

松材线虫抗逆态基因Bx-DAF6鉴定及基因沉默

为探究松材线虫抗逆态幼虫形成的分子机理,本文对抗逆态基因daf-6进行了鉴定和基因沉默研究。应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到秀丽线虫daf-6的同源基因,命名为Bx-DAF6。应用PCR技术进行Bx-DAF6完整蛋白编码区(CDS)扩增。采用RNAi技术进行Bx-DAF6沉默,分析该基因的沉默对松材线虫抗逆态幼虫形成的影响。PCR扩增得到CDS区全长2 700 bp,Bx-DAF6编码的蛋白质具有固醇传感结构域。Bx-DAF6沉默抑制了2龄幼虫转变为抗逆态幼虫,表明Bx-DAF6在2龄幼虫转变为抗逆态幼虫生理过程中起正向调控作用。      

利用PCR-RFLP方法鉴别黄曲霉毒素产毒菌株

【目的】开发一种精准度高、灵敏性好、简便快捷的鉴别黄曲霉毒素产毒菌株的方法,为粮食储藏中黄曲霉毒素污染提供早期预警,为食品工业的质量安全控制提供技术保障,为黄曲霉毒素污染的生物防治提供无毒微生物来源。【方法】利用生物信息学方法分别以黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasitieus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）的黄曲霉毒素合成基因簇中的关键调控基因aflR及其启动子序列为研究对象,采用PCR-RFLP方法对黄曲霉毒素可能产生菌株进行鉴别分析研究;为进一步验证PCR-RFLP方法对产毒菌株区分结果,利用大豆培养基对上述菌株进行发酵培养,并利用HPLC方法测定了菌株产毒能力。【结果】生物信息学分析结果表明黄曲霉毒素可能产生菌株的aflR高度同源, 但启动子和结构基因的部分碱基出现了规律性变异,并导致了限制性酶切图谱中的NheⅠ、PvuⅡ和HincⅡ等限制性酶切位点的改变;通过提取各菌株基因组DNA,PCR扩增得到aflR和启动子序列片段,测序得知片段长度分别为798 bp和 515bp;PCR-RFLP鉴定结果表明产生黄曲霉毒素菌株的aflR启动子片段经NheⅠ酶切后得到176 bp和339 bp 2个片段,不产毒菌株无该限制性酶切位点;试验进一步对黄曲霉菌和寄生曲霉菌aflR结构基因的分析发现,利用HincⅡ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的aflR的结构基因,可以分别得到3个片段（387、250和161 bp）和2个片段（548、250 bp）;利用PvuⅡ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的aflR结构基因,可以分别得到2个片段（652、146 bp）和3个片段（413、239和146 bp）;产毒试验表明,米曲霉菌和酱油曲霉菌不产生黄曲霉毒素,PCR-RFLP分析表明不产毒的黄曲霉菌的确丧失了产生黄曲霉毒素的能力;产生黄曲霉毒素各曲霉菌株之间产毒能力差异显著,不但产生的黄曲霉毒素总量高低相差几十倍,其产生的黄曲霉毒素组分也不尽相同。【结论】本研究阐明了在可能产生黄曲霉毒素关键基因aflR序列中存在的差异,通过PCR-RFLP方法快速鉴别黄曲霉菌株产毒与否,并且对黄曲霉和寄生曲霉两种曲霉进行了区分。黄曲霉毒素产生菌株鉴定方法的开发,将为粮油食品安全检测和质量控制,粮食食品生产过程的质量安全控制与监测提供基于分子水平的新型技术。