犬新孢子虫刺激小鼠免疫细胞IFN-γ和IL-12的变化

犬新孢子虫是一种传播范围极广的寄生性原虫,是导致母畜流产、死胎,新生胎儿运动或神经障碍的主要病原之一。本研究主要通过收集纯化了犬新孢子虫,制备可溶性抗原,分离培养小鼠脾细胞和树突状细胞,观察犬新孢子虫对小鼠脾细胞和树突状细胞的作用,发现犬新孢子虫滋养体抗原可以刺激小鼠T淋巴细胞和树突状细胞,分别产生很高的INF-γ和IL-12,说明犬新孢子虫感染宿主后可引起机体产生Th1型免疫反应,为进一步研究犬新孢子虫的感染和宿主免疫应答机制奠定基础。     

CpG-ODN重组质粒对猪免疫剂量的筛选研究

<正>Cp G-ODN是含有Cp G基序的寡核苷酸,Cp G基序主要是存在于细菌、病毒及非脊椎动物基因组中的特定短核苷酸序列。研究证实,人工合成的含有Cp G基序的寡核苷酸同样具有与细菌Cp G-ODN相似的免疫刺激活性,能模拟细菌、病毒的自然危险信号,诱发机体产生强烈的Th1型免疫应答。Cp GODN不仅能增强抗原特异性免疫应答,表现出强烈的佐剂活性;而且对多种疫苗抗原具有佐剂作用,能     

新孢子虫病免疫预防研究进展

新孢子虫病是由犬新孢子虫引起的一种原虫病,给养殖业带来严重经济损失。然而因对新孢子虫病的研究起步较晚且认识较浅,对该病的防制手段较为有限。随着对新孢子虫介导宿主免疫应答反应及虫体抗原等多方面的研究不断深入,新孢子虫病的疫苗研制不断取得进步。本研究从宿主抗新孢子虫感染的免疫应答及其在疫苗研制的应用方面进行概述,以期为新孢子虫病疫苗的研制提供参考。     

IL-18增强日本血吸虫DNA疫苗Sj23的免疫保护效果

将小鼠IL-18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体,构建真核表达质粒pVAX/mIL-18和pVAX/Sj23,联合或单独免疫小鼠,以pVAX1空载体作对照,免疫2次,间隔2周,2次免疫后4周攻击日本血吸虫尾蚴.体液和细胞免疫检测结果表明,联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG,较高水平的IFN-γ和IL-2.攻虫试验表明,联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%,明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%).以上试验结果表明,IL-18能明显增强Sj23 DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答,并且产生较强的保护作用.     

CpG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/c小鼠的佐剂效应

本试验初次建立了CpG ODN联合重组乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清中抗PRRSV特异性抗体IgG和呼吸道黏膜抗体s-Ig A均高于单独重组菌组(P>0.05)和单独佐剂组(P<0.01),佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组的Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及黏膜淋巴因子IL-5的活性高于单独抗原组(P>0.05)及单独佐剂组(P<0.01)。试验结果说明CpG ODN作为佐剂与重组菌鼻腔免疫小鼠后,可以提高重组菌诱导的黏膜免疫反应和Th1细胞参与的系统免疫反应,为研究安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

新孢子虫与宿主关系研究进展

新孢子虫是一种传播范围极广的寄生性原虫,是导致母畜流产、死胎,新生胎儿运动或神经障碍的主要病原之一。论文详细介绍了新孢子虫表面抗原、致密颗粒抗原及棒状体抗原等侵入相关抗原,并对新孢子虫黏附、侵入、繁殖、释放的过程和相关侵入机制等方面进行了阐述,同时探讨了虫体侵入宿主后增强机体细胞免疫、体液免疫反应状况及所引起的相关Th1/Th2型免疫应答,阐明了宿主妊娠期间抵抗新孢子虫由强至弱的动态变化及相关性,并对未来犬新孢子虫的相关研究做了展望。     

弓形虫和新孢子虫交叉反应抗原MIC7A对小鼠的免疫保护效力分析

弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫,二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用,这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A,通过将其应用于小鼠的免疫保护试验,评估该抗原对弓形虫和新孢子虫感染产生的交叉免疫保护作用。对TgMIC17A进行基因克隆和原核表达,通过免疫印迹试验鉴定其反应原性和交叉反应性。重组蛋白免疫小鼠后测定血清特异性IgG抗体水平,评价其免疫原性。二免后,分别用1×10³个弓形虫Pru速殖子、1.5×10⁷个新孢子虫Nc1速殖子攻虫,对小鼠的体重变化、存活率进行监测,并在攻虫30 d后检测各组存活小鼠的脑荷虫量,评价TgMIC17A重组蛋白免疫小鼠后对弓形虫和新孢子虫的交叉免疫保护效果。结果显示,rTgMIC17A可以被弓形虫和新孢子虫的阳性血清识别,相较于未免疫组小鼠,免疫组小鼠体内可产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01),且感染弓形虫或新孢子虫的脑荷虫量均显著降低(P＜0.01)。本研究克隆并表达了TgMIC17A,鉴定其为新孢子虫和弓形虫的交叉反应抗原。该抗原可以刺激小鼠产生较好的体液免疫反应,并对弓形虫和新孢子虫的感染产生一定的交叉免疫保护作用,可以为弓形虫和新孢子虫共感染的防治,以及筛选具有交叉免疫保护力的重组疫苗提供可借鉴的研究资料。     

小鼠对猪囊虫抗原基因TS76的免疫应答

将猪囊虫抗原基因 TS76的真核表达型质粒 VTS76单独或与 p UC18联合肌肉免疫注射于 BAL B/ c小鼠 ,以MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞 Con A刺激的增殖反应及 IL - 2的诱生活性 ,EL ISA方法检测免疫小鼠 Ig G总量和特异性抗体水平 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果发现 ,VTS76免疫小鼠各项细胞和体液免疫应答反应指数均比空白对照组小鼠显著提高 ;联合免疫组小鼠的细胞免疫应答和体液免疫应答反应指数均比 VTS76小鼠提高。由此可见 ,以 VTS76免疫小鼠可诱导其特异性细胞和体液免疫反应 ,而 p UC18又明显提高了 VTS76免疫小鼠的免疫应答水平 ,具有显著的免疫增强作用     

免疫佐剂的研究进展

佐剂是先于抗原或与抗原同时应用时,能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答,而本身并不引起机体产生免疫应答的物质。它能够激活先天性免疫应答反应、提高抗原对免疫系统的递呈和刺激作用、     

免疫刺激复合物在鼻腔免疫中的研究进展

早已证明免疫刺激复合物在注射免疫中可起着有效的强佐剂和载体输送系统。不同抗原结合形成的ISCOM也已证明在粘膜免疫中有效。Lovgren等首次用低剂量的流感病毒ISCOM单次鼻腔接种后可诱导粘膜免疫应答而产生保护作用。进一步研究结果表明,ISCOM与霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热依赖性毒素(LT)一样,可打破免疫耐受,表现强粘膜佐剂活性,产生分泌性IgA和系统免疫应答,鼻腔接种ISCOM后最为显著的特点是能引起CTL反应。与CT相比,ISCOM先产生粘膜免疫随之产生系统免疫应答,此系统免疫应答依赖于IL-12,与IL-4无关。重组霍乱毒素与相同ISCOM粒子结合后起协同作用。鼻腔接种γCTB-ISCOM后,对γCTB的IgA应答在肺中增加100倍,在远距离的生殖道粘膜免疫中增加10倍多。在生殖道中也证实可加强对OVA抗原的IgA应答,接种RSV-衣壳蛋白-ISCOM后,产生高血清抗体,同样,注射免疫后,在局部呼吸粘膜和远处生殖道和肠道粘膜中均引起强烈的Ig A应答。Herpes simplex virus、流感病毒以及Mycoplasma mycoides等的衣壳蛋白与ISCOM结合后也出现相似结果。在应答过程中,利用了RSV衣壳蛋白可锚定粘膜的特性,鼻腔接种HIV-gp120RSV-ISCOM后在雌体生殖道中可观察到很强的分泌性IgA对gp120的免疫应答。总之,病毒衣壳蛋白、细胞膜蛋白等此类抗原与ISCOM结合后依然保持其生物学活性、形态结构、可锚定粘膜以及中和病毒等特性。ISCOM是一种多用途输送系统,被应用于粘膜免疫尤其适用于鼻腔免疫,它依赖于IL-12诱导粘膜免疫,而且ISCOM能诱导Th1/Th2的平衡性应答且无耐受。     

NcFBPase通过激活小鼠巨噬细胞MAPK和AKT通路诱导炎性细胞因子表达

为探究新孢子虫果糖-1,6-二磷酸酶(NcFBPase)在宿主免疫应答中的作用,通过构建pGEX-4T-1-NcFBPase载体,诱导表达获得可溶性重组NcFBPase蛋白(rNcFBPase)并与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育,采用CCK8法筛选rNcFBPase安全浓度,Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)信号通路相关蛋白水平,ELISA检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌情况。结果显示:成功构建了pGEX-4T-1-NcFBPase原核表达载体,并获得大小为65 ku的rNcFBPase; 50μg/mL是rNcFBPase刺激小鼠腹腔巨噬细胞的安全浓度,用该浓度的rNcFBPase刺激小鼠腹腔巨噬细胞能显著提高p38、ERK和AKT蛋白的磷酸化水平;p38、ERK和AKT抑制剂预处理细胞,rNcFBPase诱导的IL-6、IL-12和TNF-α的分泌量显著降低。结果表明:NcFBPase可通过激活MAPK和AKT信号通路诱导细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的分泌,为NcF...     

细胞因子在犬新孢子虫感染中的作用

犬新孢子虫是一种专一性细胞内寄生虫，它的感染导致了宿主Th细胞的分化。一方面，刺激宿主产生Th1型细胞因子反应，这些细胞因子包括IL-12、IFN-7和INF-α。Th1型细胞因子反应同时还激活了产生氧自由基（FOR）、一氧化氮（NO）及其代谢物，这些细胞因子对犬新孢子虫均具有致命的杀伤力。另一方面，引发宿主产生IL-4、IL-5和IL-10等Th2型细胞因子，Th2型细胞因子主要在宿主妊娠过程中发挥作用。     

弓形虫免疫小鼠对新孢子虫感染的交叉免疫保护作用

为了研究新孢子虫和弓形虫的交叉免疫保护效果,以BALB/c小鼠为实验动物模型,探究弓形虫PRU(Ⅱ型)、VEG(Ⅲ型)虫株免疫对新孢子虫Nc-1虫株的交叉免疫保护作用。分别用PRU和VEG免疫小鼠,3周后用Nc-1虫株大剂量攻虫,对各组小鼠的临床症状、体重和死亡情况进行监测。30 d后检测各组小鼠血清中2种寄生虫的抗体效价与新孢子虫脑荷虫量,评价弓形虫PRU、VEG虫株与新孢子虫之间的交叉免疫保护作用。结果显示,各组小鼠血清中同时存在针对新孢子虫及弓形虫的抗体,与未免疫弓形虫组相比小鼠的新孢子虫脑荷虫量明显下降(P0.05)。表明弓形虫与新孢子虫之间存在交叉抗原,弓形虫感染后产生的免疫力对新孢子虫的再感染具有一定的交叉保护效果。     

3类CpG ODNs正调节猪IP-10基因的表达研究

CpG ODN诱导不同物种先天性免疫反应的分析结果表明,诱导细胞因子(CK)分布的种类和水平存在明显的异同。试验对3类CpG ODNs(A、B、C类)如何激活猪先天性免疫生物标记及猪免疫细胞在体内外培养(含CpGODNs)中的先天性免疫反应动力学进行了研究。利用实时定量PCR(SYBR Green)分析了细胞因子和趋化因子基因的mRNA表达水平。结果发现,A-类CpG ODN可显著诱发IFN-γ、IL-12(P40)、IL-6、IL-4、TNF-αmRNA的瞬间表达;C-类CpG ODN可显著诱发IFN-γ、IFN-α、IL-12 mRNA的表达,并使IL-4(Th-2型)mRNA降至最低表达水平,GCODNs可刺激使一些细胞因子的表达水平降至最低;B-classGpC ODN7909能显著影响IL-12(P35)mRNA表达水平。值得注意的是,12 h时3类CpG ODNs刺激均可显著诱导IP-10的mRNA表达。体内外试验结果表明,IP-10可作为CpG ODNs诱发猪免疫活性的生物标记。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒抑制神经细胞干扰素的产生

猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)属于β属冠状病毒成员,其具有典型的嗜神经性。多种冠状病毒可逃避宿主先天性免疫的识别而表现出明显的致病性,但宿主的先天性免疫在PHEV感染过程中发挥的作用还不是很清楚。为了明确神经细胞在PHEV感染过程中细胞自身的免疫应答状况,本研究对参与先天性免疫的重要炎性细胞因子和相关的通路变化情况进行了检测分析。用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对PHEV感染小鼠脑神经瘤母细胞(N2a)不同时间点的样品进行检测,结果证明没有IFN-β的表达,说明PHEV不能引起神经细胞产生Ⅰ型IFN。收集感染N2a细胞24h的上清,ELISA方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的分泌情况,仅有IL-6呈现高水平表达,说明PHEV感染N2a细胞诱发了IL-6的先天性免疫反应。免疫荧光方法检测PHEV感染N2a细胞24h后重要核转录因子IRF-3和NF-κB的核定位情况,发现NF-κB移位到了胞核,IRF-3仍然存在于胞浆,说明PHEV仅激活了NF-κB信号通路。以上试验结果表明,PHEV进入中枢神经系统时可逃避神经细胞以IFN-β为主的免疫识别,该结果可为深入开展PHEV抑制机体干扰素产生的机制研究奠定基础。     

CpG寡核苷酸增强鸡新城疫疫苗免疫效力的研究

为了探讨CpG寡核苷酸（CpG oligonucleotide,CpG ODN）对鸡新城疫疫苗免疫效力的影响,将CpG2007与鸡淋巴细胞共孵育,测定淋巴细胞增殖率,结果发现CpG2007对鸡淋巴细胞具有显著的刺激活性。将CpG2007与不同浓度的新城疫抗原混合,制备灭活疫苗,免疫健康雏鸡。分别于免疫后不同时间采血,测定抗体效价和细胞因子表达量,并进行攻毒保护试验。结果发现,添加CpG ODN佐剂的试验组均比对应相同抗原剂量的免疫对照组的抗体水平高,产生抗体速度快;抗原剂量降低10倍的佐剂试验组与高抗原剂量免疫对照组抗体水平和攻毒保护率均相当,表明CpG ODN能显著增强新城疫疫苗的免疫效力,能促进机体产生更强烈的免疫应答,是有效的疫苗佐剂候选物质。     

羊口疮病毒B2L、F1L基因融合真核表达质粒诱导小鼠的免疫应答及IL-2对其作用影响的研究

为评价羊口疮病毒(OrfV)B2L、F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及IL-2对其免疫作用的影响。本研究将构建的pVAX1-B2L-F1L真核质粒转染MDBK细胞后,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测B2L-F1L融合基因在MDBK细胞中的表达;将pVAX1-B2L-F1L、pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1空载体、生理盐水对照组KM系小鼠通过后腿肌肉注射的方式免疫,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ)、Th2型(IL-4、IL-6)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-B2L-F1L重组质粒能够在MDBK细胞中表达;pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体及IL-2和IFN-γ水平均显著高于pVAX1-B2L-F1L组;该联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6细胞因子水平与pVAX1-B2L-F1L组相比差异不显著(p>0.05);该联合免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L-F1L组(p<0.05)。由此表明,pVAX1-B2L-F1L能够诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫应答,联合pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能够促进Th1型细胞因子的分泌。本研究为OrfV基因工程疫苗的研制提供了参考依据。     

新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答

为了研究新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白对动物的免疫效果,利用重组表达的NcSRS2和NcSAG1蛋白与弗氏佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠抗新孢子虫抗体水平和血清中IL-4和IFN-γ含量。结果表明,免疫后的BALB/c小鼠IgG、IgG2a和IFN-γ抗体表达水平升高,IgG1抗体和IL-4表达水平也升高,表明NcSRS2和NcSAG1重组蛋白可激发机体产生Th1型和Th2型免疫反应,且NcSRS2重组蛋白的免疫增强效果与NcSAG1重组蛋白免疫组的差异具有显著统计学意义(P0.05)。本研究结果为研制高效安全的抗新孢子虫的新型疫苗提供了参考。     

淫羊藿苷对小鼠骨髓树突状细胞分化及成熟的影响

研究淫羊藿苷(ICA)对小鼠髓源树突状细胞(DC)分化及成熟的影响。小鼠骨髓细胞用GM-NSF和IL-4培养5 d,然后用免疫磁珠法纯化DC细胞,试验组分别加入淫羊藿苷2、5、10和20 mg/m L,空白对照组加等量RPMI-1640,阳性对照组加脂多糖(LPS),6组分别同时作用48 h。流式细胞仪检测CDllc、主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子及协同刺激分子CD80、CD86表达水平和细胞摄取抗原的能力,ELISA检测产生的细胞因子(IL-2、IL-10、IL-12),混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。结果表明:4个添加淫羊藿苷组的CD80、CD86、CDllc、MHC-Ⅱ类分子表达水平均明显高于空白对照组,分泌IL-2、IL-10、IL-12能力比空白对照组增加,吞噬FITC-dextran的能力下降,并可促进同种异基因T细胞的增殖。说明淫羊藿苷可以促进体外培养的小鼠髓源DC的成熟,促进DC诱导的免疫应答启动。