肥大细胞及其介质组胺的生殖功能

肥大细胞(Mast cell,MC)是结缔组织的一种细胞成分。它能释放多种介质,其中组胺(Histamine,HA)是最重要且研究较详细介质之一。对 MC 和 HA 的功能,一般多论及在Ⅰ型变态反应的作用,但近年发现MC 和 HA 与生殖系统的周期变化及生殖功能有密切关系。一、MC 和 HA对卵巢的作用(一)卵巢内 MC 的分布:在大鼠卵巢,MC 主要分布在髓质和卵巢门的结缔组织中,但卵泡膜和黄体中均未发现 MC。仓鼠卵巢内MC,在各部的分布是不均匀的,进出入卵巢血管的周围最多,约占42％;卵巢囊为37％,卵巢囊肌上皮细胞层为20％;卵巢门最少,约占1％。与大鼠和仓鼠不同,牛卵巢内 MC 主要见于卵泡     

副交感神经对妊娠早期大鼠子宫组织胺和血清LIF水平的影响

为研究大鼠副交感神经对妊娠早期子宫内组织胺(HA)和血清白血病抑制因子(LIF)的影响,选取180~200日龄健康性成熟Wistar雌性大鼠20只,随机分为对照组和处理组,处理组采用腹腔注射阿托品阻断副交感神经,对照组腹腔注射0.9%生理盐水。结果表明:阿托品处理后妊娠5d子宫囊胚数量明显减少、囊胚发育延迟;妊娠6d虽然囊胚数量接近正常对照组数量,但胚胎凸起仍小于正常妊娠6d状态。子宫肥大细胞(MC)释放HA结果显示,阻断副交感神经激发MC释放的HA量显著高于正常状态,且与MC自发释放的HA变化趋势不同;正常对照组血清LIF含量的变化趋势是随着妊娠时间的增加而减少,而处理组出现相反的趋势。试验结果提示,在着床窗口期副交感神经通过对MC释放HA等介质调控子宫的生理功能,HA和LIF分泌规律紊乱对胚胎着床的影响更为显著,导致囊胚发育延迟,甚至丢失。     

金黄色葡萄球菌FnbpA的CD4~+ T细胞表位鉴定

金黄色葡萄球菌(S.aureus)表达的菌体表面纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)在感染早期与宿主细胞粘附过程中起关键作用,将其免疫小鼠后能够诱导机体产生强烈的Th1和Th17反应。但FnbpA诱导Th1和Th17反应的CD4~+ T细胞表位尚不清楚。本研究根据FnbpA二级结构及其与MHCⅡ分子的结合能力对CD4~+ T细胞表位进行预测与分析,选择并合成7个候选CD4~+ T细胞表位肽。将每个表位肽分别对FnbpA免疫的C57BL/6小鼠CD4~+ T细胞进行体外刺激,通过检测CD4~+ T细胞增殖及其分泌的细胞因子水平对免疫优势表位进行初步鉴定。再以初步鉴定的优势表位肽段免疫小鼠,并检测其诱导的特异性细胞免疫应答水平。结果表明,表位肽F5(FnbpA488-505)能够显著诱导CD4~+ T细胞增殖并分泌高水平IFN-γ和IL-17A,而且F5在不同S.aureus菌株中高度保守。表明FnbpA_(488-505)是诱导CD4~+ T细胞分化为Th1/Th17的T细胞表位。本研究为S.aureus的FnbpA表位肽疫苗的进一步设计提供了实验依据。     

青海牦牛卵巢颗粒细胞体外培养及kisspeptin-10对其孕酮分泌的影响和机制研究

体外培养牦牛卵巢颗粒细胞,并研究Kisspeptin-10对其孕酮分泌的作用和可能机制。于屠宰场选取适宜卵巢后在4h内运回实验室,抽吸法提取细胞,并通过卵泡刺激素受体(FSHR)抗体验证培养的颗粒细胞纯度,HE染色观察细胞形态,CCK测细胞生长曲线;不同浓度的Kisspeptin-10、Verapamil单独或共同处理细胞24 h后,分别收集细胞和上清,通过流式细胞仪检测细胞内Ca~(2+)浓度,ELLSA测上清内孕酮含量。结果显示,FSHR阳性率>97%,验证了细胞为卵巢颗粒细胞;使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养液培养,可获得生长良好的牦牛卵巢颗粒细胞。颗粒细胞呈多角形或梭形,并伸出伪足,呈放射状生长。培养24 h后,颗粒细胞进入对数生长期,于72 h后进入平台期;Kisspeptin-10处理可显著增加颗粒细胞的活力,100 nmol·L~(-1)时可显著促进孕酮的分泌;钙离子阻断剂Verapamil会降低孕酮的分泌,于20、50 nmol·L~(-1)时,达显著降低水平(P<0.05);100 nmol·L~(-1) Kisspeptin-10与不同浓度的Verapamil共同处理时,孕酮含量有所提升,但不能逆转其对孕酮分泌的抑制作用(P>0.05);流式细胞仪检测胞内Ca~(2+)浓度,其结果与检测的颗粒细胞孕酮分泌水平相一致。综上,Kisspeptin-10能促进体外培养的牦牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌,其机制可能与胞内Ca~(2+)浓度相关。     

奶牛子宫组织肉肥大细胞分布规律的研究

肥大细胞(MC)是一种包含嗜碱性颗粒的多功能细胞,广泛存在于人和动物体内.MC能分泌多种介质,参与多种生理反应,与动物某些变态反应性疾病、寄生虫感染、某些非特异性炎症和肿瘤性疾病有密切关系.要揭示MC在奶牛生殖中的各种作用,就必须首先揭示其在子宫内不同部位的分布规律,这是研究子宫内MC的基础性工作.为此,特设计并实施了本试验.     

奶牛子宫组织内肥大细胞分布规律的研究

肥大细胞（MC）是一种包含嗜碱性颗粒的多功能细胞，广泛存在于人和动物体内。MC能分泌多种介质，参与多种生理反应，与动物某些变态反应性疾病、寄生虫感染、某些非特异性炎症和肿瘤性疾病有密切关系。要揭示MC在奶牛生殖中的各种作用，就必须首先揭示其在子宫内不同部位的分布规律，这是研究子宫内MC的基础性工作。为此，特设计并实施了本试验。     

制何首乌水提液对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及OPG-RANKL mRNA表达的影响

为研究制何首乌水提液对小鼠成骨细胞MC3T3-E1的影响,将不同浓度的制何首乌水提液作用于MC3T3-E1细胞,采用噻唑蓝(MTT)法、碱性磷酸酶(ALP)活力检测试剂盒和实时荧光定量PCR法对细胞增殖、ALP蛋白分泌及骨保护素(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达水平进行检测。结果显示,药物作用2d和3d后,各浓度制何首乌水提液均可促进MC3T3-E1细胞增殖;药物作用6d后,各浓度制何首乌水提液均可促进MC3T3-E1细胞分泌ALP;药物作用1d后,较高浓度制何首乌水提液可上调MC3T3-E1细胞OPG/RANKL mRNA表达比。表明制何首乌水提液具有促进成骨细胞增殖、分化和上调成骨细胞OPG/RANKL mRNA表达比的作用。     

牛皮蝇HA基因克隆及分泌型真核表达载体的构建

为了构建牛皮蝇的皮蝇素A(hypodermin A,HA)基因的分泌型真核表达载体pEF1α-HAAcGFP,并在Cos7细胞中表达与鉴定,试验从牛皮蝇中提取RNA,反转录成cDNA,扩增出HA基因,并在HA基因序列的上游加1段信号肽序列;通过双酶切将带有信号肽的HA基因序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP中,得到分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP;再利用脂质体法转染Cos7细胞,并以RT-PCR和Western-blot技术在RNA和蛋白水平上检测HA基因是否在Cos7细胞中表达。结果表明:经双酶切及测序鉴定,分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP构建成功;转染Cos7细胞后,在RNA和蛋白水平上能检测到HA基因的表达。说明成功构建了HA基因的分泌型真核表达载体PEF1α-HA-AcGFP。     

大鼠发情周期中子宫内肥大细胞和组织胺含量变化的观察

采用阴道涂片法鉴定大鼠所处的发情阶段,应用甲苯胺蓝染色观察肥大细胞(MC)在大鼠发情周期不同阶段子宫内的分布、形态和数量的变化规律,应用荧光分光光度计检测大鼠发情周期不同阶段子宫内组织胺(HA)的含量变化。结果显示,在大鼠发情周期中,MC在子宫内不同部位内的分布存在明显的差异,数量依次为:子宫角子宫体子宫颈。大鼠子宫各部位在发情周期各阶段内MC的数量依次为:发情后期(ME)发情前期(PE)发情间期(DE)发情期(E),子宫角内不同生理阶段MC的数量之间差异极显著(P0.01);子宫体、子宫颈内发情后期与发情期内MC数量差异极显著(P0.01),发情间期与发情前期内MC数量差异不显著(P0.05)。子宫各部位在发情周期各阶段内HA的含量依次为:发情后期(ME)发情前期(PE)发情间期(DE)发情期(E),子宫角中的HA含量在发情后期明显高于其他3个时期(P0.05),子宫体和子宫颈内HA含量在发情周期各阶段中差异均不显著(P0.05)。研究表明,根据阴道细胞类型的变化来确定大鼠发情周期的各阶段是可行的。大鼠子宫内MC的数量及形态随发情周期阶段的变化而改变,对子宫的局部免疫具有重要的作用。发情周期子宫内HA含量的变化与MC的变化一致,MC主要通过释放HA发挥调节子宫尤其是子宫角的局部免疫水平的作用,在一定程度上,可以将子宫角组织中MC的数量作为HA含量的指标。     

干扰素α对小鼠Tfh细胞分化的调控作用

通过体外试验观察干扰素-α(IFN-α)对滤泡辅助性T细胞(Tfh)分化及功能的影响。无菌分离小鼠脾细胞,磁珠分选CD4^+T细胞,加入抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体,重组IL-21、IL-6进行刺激,同时加入重组IFN-α(设不加IFN-α的阴性对照)进行培养,分别在培养后的1、3、5d,流式细胞术检测Tfh细胞(CD4^+CXCR5^+)和CD4^+CXCR5^+PD-1^+细胞的比例;ELISA检测细胞上清中Tfh细胞功能性细胞因子IL-4、IL-21的水平;real-time PCR检测培养3d后Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6以及细胞因子IL-21mRNA的表达水平。结果表明,与阴性组相比,IFN-α能明显促进Tfh细胞的分化及Tfh细胞中PD-1的表达(P<0.05),能提高Tfh细胞功能性细胞因子IL-4、IL-21的分泌水平(P<0.05);IFN-α能正向调控Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6以及细胞因子IL-21mRNA的表达水平(P<0.05)。说明IFN-α可通过正向调控STAT1、Bcl-6的表达,促进Tfh细胞的分化和细胞因子的分泌。     

利用酯酶染色对羊传染性脓疱皮炎病羊和免疫羊T淋巴细胞值的测定

淋巴细胞是机体重要的免疫细胞,按其免疫功能和细胞膜受体可分为 T 细胞和 B 细胞,而 T 细胞是细胞免疫的基础。T 细胞内有非特异性酯酶,在酸性条件下能将α-醋酸萘酯水解,产生醋酸离子和α-萘酚,α-萘酚与六偶氮斟品红偶联,在 T淋巴细胞浆中酯酶存在的部位生成不溶性红褐色沉淀物,在普通显微镜下将 T、B 细胞加以区别。羊患传染性脓疱皮炎时,抗体水平低下,各种凝集反     

信号肽序列对A型流感病毒H1N1 HA蛋白表达的影响

为了探究信号肽对A型流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin, HA)表达的影响,扩增了病毒的HA基因,利用双酶切方法将HA基因分别克隆至pCMV-Flag-N及pCMV-Flag-C载体中,成功获得了包含HA信号肽的SP-HA-Flag载体和缺失信号肽的Flag-HA载体,将重组质粒转染至293T细胞后利用Western blot及间接免疫荧光方法检测HA蛋白表达情况。结果表明,该信号肽显著下调HA蛋白的表达量,并调控HA在细胞内的定位:含信号肽序列的HA蛋白主要定位在细胞膜,而不含信号肽的HA蛋白则主要定位在细胞质。本研究为进一步研究流感病毒HA蛋白的生物学功能提供了基础信息。     

白细胞介素-10的生物学功能及其在疾病中的作用研究进展

白细胞介素-10(IL-10)是一种多效性细胞因子,可抑制T细胞、单核细胞和巨噬细胞的活性和效应功能,其主要功能是限制或终止炎症反应。除此之外,IL-10还能调节B细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞和辅助T细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、角化细胞和内皮细胞的生长或分化。文章综述其主要的生物学功能及其与多种疾病间的关系。     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立

通过3次sp2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞间的融合试验,筛选出7株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中2G_6细胞株作了进一步的检定分析,用2G_6上清液对T.e抗原进行ELISA试验,显示出高度的特异性,与血吸虫、弓形虫均未出现交叉反应。效价为1∶5.1×10~3,诱生腹水抗体的效价为1∶1.6×10~7,免疫球蛋白类型属IgG_1亚美。该细胞株在外培养下,稳定地分泌特异性抗体已达6个月之久,在液氮冻存近8个日之后仍深持分泌抗体的能力。     

组胺的免疫功能及临床医学研究近况

组胺(histamine HA)是最早发现的参与炎症和过敏反应的化学介质。1907年已由人工合成。但是直至石坂夫妇(1967)发现IgE抗体以后。才开始从分子水平对肥大细胞、嗜碱细胞中HA分泌机理加以研究。近年来,随着H_2受体和HA对免疫系统的调节作用的     

布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的亚细胞定位及与宿主细胞互作蛋白的筛选

【目的】 分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】 通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组荧光定位载体,转染人胚肾上皮细胞293T,通过扫描激光共聚焦显微镜观察BPE005的细胞定位;构建PGBKT7-BPE005诱饵载体,验证诱饵载体是否有细胞毒性和自激活现象;以小鼠巨噬细胞RAW264.7 mRNA的cDNA文库为AD文库菌液,检测文库滴度,通过酵母双杂交系统筛选宿主细胞内与BPE005相互作用的靶蛋白。【结果】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005属于疏水性蛋白,内含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链。成功构建PDRRED2-C1-BPE005荧光定位载体和PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体,BPE005定位于宿主细胞核。PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体无酵母细胞毒性和自激活现象,AD文库菌液滴度>2×10⁷/mL,筛选出4个宿主细胞内与BPE0005存在相互作用的蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、补体因子H、鸟苷酸环化酶2G及颗粒蛋白。经复筛、测序、BLAST比对、一对一验证后,最终筛选出1个在宿主细胞内与BPE005具有较强相互作用的靶蛋白(RNA聚合酶Ⅱ多肽G)。对该蛋白的作用网络分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G对宿主细胞内mRNA的转录和合成具有重大影响。【结论】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005定位于宿主细胞核,在宿主细胞内可与RNA聚合酶Ⅱ多肽G产生较强相互作用,对进一步阐明布鲁氏菌感染过程中关键效应分子的作用机制具有指导意义。     

猪细小病毒S—1毒株的分离和鉴定(二)

S一1毒株在猪肾原代细胞第1～10代之间共进行36次传代,培养物的平均HA价>384,第6代以后对细胞的最小感染量稳定在10~(-6)～10~(-7)之间,第5代PK细胞传代毒在-25℃～-30℃保存180天毒价保持10~(-5)不变,死产胎猪组织(S—1毒株分离猪)在用同样温度保存300天能重复分离到病毒,S—1毒株PK传代毒能适应于胎猪睾丸细胞株(ST)增殖,毒价达1O~(-7),以比利时荧光抗体柒色ST细胞培养物和用比利时PPV阳性血清对ST细胞传代毒作HI测定,进一步证实分离物的特异性。用PK细胞传代毒感染HI抗体阴性怀孕头胎母猪能产生明显的抗体反应。3头感染母猪中,1头(用口服途径攻毒)在感染后2～4天间出现排毒现象;从另一头母猪(用肌肉注射途径攻毒)的胎儿中分离到病毒,证实经胎盘感染的发生。     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备CIAV VP2单克隆抗体,将原核表达的His-VP2融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将原核表达的GST-VP2融合蛋白作为包被抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞克隆,分别命名为3D7、3B8、2D3。经间接ELISA测定,以上3株杂交瘤细胞腹水效价分别为1:8.0×10~5、1:4.0×10~5,以及1:6.4×10~6,亲和力解离常数分别为7.34×10~(-11)、2.65×10~(-11),以及2.98×10~(-11)。IgG亚类分别为IgG1、IgG2b以及IgG2b。经Western Blot试验证明,3D7株单抗能特异地识别CIAV VP2蛋白,其识别的抗原表位区域为VP2 N-端的20~40 aa。经IFA试验证明,3株单抗均能识别天然的CIAVVP2蛋白。此单抗为研究CIAVVP2的生物学功能和CIAV致病机理奠定基础。     

β-葡聚糖的免疫增强作用机理研究进展

β-葡聚糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染等多种生物活性和功能。β-葡聚糖作为非特异性的免疫调节剂，不仅能激活免疫细胞，还能促进细胞因子生成，激活补体系统，促进抗体产生，对免疫系统发挥多方面的调节作用。作者将对β-葡聚糖免疫增强的分子机理的研究进展作一概述。近年来从分子水平研究结果表明，多糖通过与巨噬细胞和嗜中性粒细胞、淋巴细胞表面多糖受体相结合，影响细胞的信息传递过程，从而影响这类细胞基因表达和淋巴细胞功能，调节机体免疫功能，淋巴细胞的多种功能均与细胞内cAMP和cGMP的含量及其比值变化有关。研究结果显示，β-葡聚糖具有调节细胞内cAMP和cGMP水平的功能。 另外，β-葡聚糖对免疫细胞NO生成具有明显的促进作用，并与干扰素具有协同促进作用，多糖可影响淋巴细胞前列腺素的分泌，调节免疫功能。阐明多糖的免疫学机理有助于开发新型免疫增强制剂。     

雷美替胺对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响

本实验旨在研究雷美替胺(Ramelteon)对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响。在猪卵母细胞体外成熟42 h培养过程中添加10~(-11)、10~(-9)、10~(-7)、10~(-5)mol/L的雷美替胺,不添加雷美替胺组作为对照组。通过卵丘细胞扩散指数对猪卵丘细胞的扩散程度进行判定,并统计猪卵母细胞体外成熟率及孤雌胚胎发育能力;进一步检测猪卵母细胞内谷胱甘肽和活性氧水平及孤雌胚胎发育相关基因的表达情况。结果表明:与对照组相比,添加10~(-11)mol/L的雷美替胺能显著提高卵丘细胞扩散指数,显著提高谷胱甘肽水平,显著降低活性氧水平,调控与胚胎发育相关的POU5F1、NANOG和SOX2基因表达量。综上所知,在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加10~(-11) mol/L雷美替胺可显著提高猪卵母细胞质量和后续胚胎发育潜力。