口蹄疫病毒Asia—I型灭活的研究

本研究将适应ＢＨＫ２１细胞培养的口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）亚洲Ｉ型（Ａｓｉｓａ－Ｉ）用胺类衍生物作灭活剂进行灭活试验。灭活毒经细胞连续传代检测未产生致细胞病病作用；经接种实验动物观察，无致细胞病作用且有良好的免疫原性。     

口蹄疫病毒灭活的研究

将兔体传代的Ｏ型口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）适应ＢＨＫ（２１）细胞培养，该细胞毒的ＴＣＩＤ（５０）达７～７．６。在ｐＨ７．９的介质中，用胺类衍生物能使ＦＭＤＶ彻底灭活。给豚鼠接种灭活毒后１个月攻击强毒，能极有效地保护豚鼠抵抗强毒攻击，实验动物的保护达１００％．     

口蹄疫病毒灭活的研究

将兔体传代的Ｏ型口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）适应ＢＨＫ２１细胞培养，该细胞毒的ＴＣＩＤ５０达７－７．６。在ＰＨ７．９的介质中，用胺类衍生物能使ＦＭＤＶ彻底灭活。给豚鼠接种灭活毒后１个月攻击强毒，能极有效地保护豚鼠抵抗强毒攻击，实验动物的保护达１００％。     

甘南牦牛口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗免疫效果分析

为了解口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗对甘南牦牛的免疫保护情况,试验应用ELISA方法对30头牦牛不同免疫阶段的血清进行了抗体监测。结果表明:除免疫前口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗产生的抗体水平较低外,在一免后30天和二免后30,90,150天均能达到群体免疫保护水平,且在二免30天时最高,持续2~3个月后有下降趋势,在免疫5个月后下降至70.00%左右,但仍具有保护力。说明用甘南牦牛口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活苗免疫牦牛产生的抗体水平符合国家规定的要求,且能维持较高水平,免疫效果良好。     

牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗与猪用口蹄疫O型灭活苗对猪的免疫效果比较试验

使用牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗与猪用口蹄疫O型灭活苗分别接种50d商品猪和怀孕90d种猪,免疫前和免疫后的3w及7w进行抗体水平检测。O型口蹄疫采用正向间接血凝试验、AsiaⅠ型口蹄疫采用液相阻断ELISA检测。同时对接种猪进行免疫应激观察。结果显示:猪使用牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗3W后口蹄疫AsiaⅠ的抗体水平十分低,最高只有5%,口蹄疫O型抗体合格率在35%以上;而注射猪用口蹄疫O型灭活苗的O型抗体水平合格率只有35%。而牛用口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活苗两次接种后,Asia I和O型抗体水平均达到大于70%的要求。     

口蹄疫O型、AsiaⅠ型免疫抗体的检测

用口蹄疫O型和Asi aⅠ型双价疫苗对牛、羊进行免疫,于免疫后一个月和五个月,分别用口蹄疫O型和Asi aⅠ液相阻断ELISA型试剂盒进行抗体监测。结果牛在免疫后一个月,O型抗体水平≥1:128的占91.96%,免疫后五个月O型和Asi aⅠ型的抗体仍维持较好水平,≥1:128的比率接近50%,说明免疫效果较理想。同时对免疫后一个月血清的液相阻断ELISA法和正向间接血凝法(IHA)测定结果进行了比较,经统计学分析,其相关系数为r=0.8854,说明两种方法检测结果较相近,两者间有较好的相关性,且液相阻断ELISA法比IHA所测定的滴度普遍偏高。     

木鳖子提取物对Asia Ⅰ-O型口蹄疫双价灭活苗的免疫佐剂作用

分别将2 500、500、100、20μg的木鳖子提取物(ECMS)或100 μg皂树皂甙(QA)和Asia Ⅰ-O型口蹄疫(FMD)双价灭活苗混合免疫豚鼠,以不另加佐剂的疫苗为对照组,于二免后3、6、10、14周采血并分离血清,观测血清中抗O型FMDV的抗体滴度、抗O型FMDV VP1结构蛋白抗体水平和抗Asia Ⅰ型FMDV的抗体水平.结果显示,当ECMS剂量等于或少于500 μg时,ECMS和FMD双价灭活苗混合免疫豚鼠,未见不良反应;疫苗中加入ECMS和QA后,则诱导更高的抗O型FMDV抗体滴度、抗O型FMDV VP1结构蛋白抗体和抗Asia Ⅰ型FMDV抗体水平,尤其ECMS100 μg组和QA 100 μg组(P＜0.01)或(P＜0.05);且ECMS 100 μg组抗体水平高于QA 100 μg组.本研究结果提示ECMS可作为FMD灭活疫苗的候选佐剂.     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因结构预测及亚细胞定位

利用PCR方法扩增到VP1基因,序列测定后利用Mega4．0、swiss—model、GOR4和RasMol软件预测了VP1基因的二、三级结构。将VP1基因融合EGFP基因后定向克隆入PcDNA3．1（＋）真核表达载体,构建正确的重组质粒命名为PVP1E,在脂质体介导下将PVP1E质粒转染BHK-21细胞,WesternBlotting试验证实VP1基因成功表达,经DAPI细胞核染色后在共聚焦显微镜下观察VP1亚细胞定位。结果表明本研究预测了VP1基因的二、三级结构,其在BHK-21细胞中呈现以细胞核为主的弥散性分布,VP1基因亚细胞定位及结构预测为进一步深入探究AsiaI型FMDVVP1结构和功能提供丰富的资料。     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究

本研究用纯化的Asial型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术方法,经筛选获得6株能稳定分泌抗Asial型FMDV单抗的杂交瘤细胞株。以牛抗口蹄疫病毒IgG为捕获抗体,选择一株单抗(184)用辣根过氧化物酶标记(HRP-184)作为检测抗体,建立了检测Asial型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出0.5859μg纯化Asial型FMDV抗原和2.5×10~3TCID_(50)病毒,对O型FMDV、牛结核病、牛肺疫、牛流热、赤羽病、牛传染性鼻炎等病毒进行检测,均为阴性,无交叉反应发生。本研究建立的FMDV抗原捕获ELISA方法,具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可用于Asial型FMDV的特异性检测。     

天峻县牛羊AsiaⅠ-O型口蹄疫免疫抗体检测

为了探讨口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活苗免疫接种牦牛、藏羊后产生抗体效价,项目对天峻县阳康乡的牦牛、藏羊开展AsiaⅠ-O型口蹄疫疫苗的抗体效价检测,试验结果表明,口蹄疫AsiaⅠ-O型二价灭活疫苗免疫效果依次为成年牦牛、成年藏羊、犊牛、羔羊;免疫后Ⅰ型抗体分析结果与O型免疫抗体的免疫效果一致,免疫合格率在80%以上,免疫牛羊产生的整体抗体水平能够符合国家规定的要求。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础.     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒AsiaⅠ型P12A3C基因的克隆与序列分析

试验克隆了AsiaI流行株JS2005的P12A3C基因,并将其插入自杀式表达载体pshame2a中,构建成自杀式真核表达载体,为自杀式DNA疫苗的研究奠定基础。     

悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活工艺研究

采用单独使用二乙烯亚胺（BEI）灭活剂30℃、26℃灭活以及二乙烯亚胺-甲醛（BEI-FA）联合灭活3种方法对悬浮培养生产的猪口蹄疫O型ZK/93病毒液进行灭活,考察和评价各种方法对该毒株146S的影响及灭活安全性。根据对3批口蹄疫病毒灭活后检测结果来看,单独使用BEI 26℃灭活方法虽然对146S的损失率小,但存在一定的安全隐患,未经过大量试验证实及确认之前不应使用。而经BEI-FA联合灭活方法获得的抗原安全性检验符合规定,但该方法对口蹄疫抗原146S的损失率较高,不宜推广和使用。与上述两种方法相比,用BEI灭活剂30℃灭活28 h仍是最佳的灭活方法。     

悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活工艺研究

<正>采用单独使用二乙烯亚胺(BEI)灭活剂30℃、26℃灭活以及二乙烯亚胺-甲醛(BEI-FA)联合灭活3种方法对悬浮培养生产的猪口蹄疫O型ZK/93病毒液进行灭活,考察和评价各种方法对该毒株146S的影响及灭活安全性。根据对3批口蹄疫病毒灭活后检测结果来看,单独使用BEI26℃灭活方法虽然对146S的损失率小,但存在一定的安全隐患,未经过大量试验证实及确认之前不应使用。而经BEI-FA联合灭活方法获得的抗原安全性检验符合规定,但该方法对     

悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活工艺研究

采用单独使用BEI灭活剂30℃灭活、单独使用BEI灭活剂26℃灭活及BEI—FA联合灭活等三种方法对猪口蹄疫O型ZK／93毒株进行灭活,考察和评价各种方法对该毒株146s的影响及灭活安全性。根据对三批口蹄疫病毒灭活后检测结果来看,单独使用BEI,26℃灭活方法虽然对146S的损失率小,但存在一定的安全隐患,未经过大量试验来证实及确认之前应不能使用该方法。而经BEI—FA联合灭活方法获得的抗原灭活安全陛检验符合规定,但该方法对口蹄疫抗原146S的损失率较高,不宜推广和使用。与上述两种方法相比,用BEI灭活剂30℃灭活28h仍是最佳的灭活方法。     

牛口蹄疫Asia Ⅰ型灭活疫苗研究——制苗用种毒的选择

用不同保存时期亚洲Ⅰ型口蹄疫（Ａｓｉａ Ⅰ）３株牛源强毒株回归牛体,经乳鼠传代、转适ＢＨＫ－２１传代细胞、用ＢＥＩ灭活,制成双相油佐剂疫苗免疫豚鼠,对各个毒株的毒力、免疫原性、血清中和抗体、对抗原免疫应答的广谱性以及各种制苗材料的适应性进行综合分析,从中选出毒力强、免疫原性好和抗原谱较广的Ａｓｉａ Ⅰ ＣＦ３株作制苗用种毒。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗毒株不同宿主系传代中VP1基因的遗传变异研究

口蹄疫病毒结构蛋白VP1参与构成病毒粒子的主要中和抗原位点,是4种结构蛋白中最易发生变异的。在病毒传代过程中,对VP1基因进行遗传变异分析是口蹄疫疫苗研制中不可或缺的环节。为此,作者扩增了经不同宿主系（乳鼠、BHK₂₁细胞）连传不同代次的AsiaⅠ型毒株的VP1基因,并对其进行遗传变异分析,毒株间核苷酸同源性为99.4%~99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.6%~100%;制苗毒株经过不同宿主系有限传代后,与传代前的原毒(MF1)相比,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点较稳定,说明以此种方式获得的制苗毒株制备的灭活疫苗是稳定的,适用于该毒株流行区域内相关家畜的免疫预防。     

口蹄疫O型、AsiaⅠ型二价灭活疫苗的研制与应用

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性的烈性传染病,一旦发病极易形成暴发大流行,发病率几乎达100%,不易控制和消灭,国际兽医局(OIE)一直将其列为A类动物疫病之首,我国将其规定为一类疫病。因该病的发生,往往对一个国     

口蹄疫O型、Asia Ⅰ型二价灭活疫苗的研制与应用

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性的烈性传染病,一旦发病极易形成暴发大流行,发病率几乎达100％,不易控制和消灭,国际兽医局（OIE）一直将其列为A类动物疫病之首,我国将其规定为一类疫病。因该病的发生,往往对一个国家的畜牧业生产、肉品供应、畜产品国际贸易及外交政治关系造成重大负面影响,又称为“政治经济病”。