SMAD2介导的Activin A信号对人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞诱导分化的促进作用

【目的】研究SMAD2在Activin A促进人胚胎干细胞向限定性内胚层诱导分化中的作用。【方法】在人胚胎干细胞中转染SMAD2基因siRNA或者过表达质粒后,收集经Activin A分别诱导0,6,12,24,48,72,96和120 h的细胞各100 ng/mL,采用实时定量PCR检测SMAD2 与内中胚层共同前体标记Brachyury和内胚层标记Sox17的表达,进一步通过Western-blot分析Activin A诱导中SMAD2和磷酸化SMAD2（p-SMAD2）表达的变化。【结果】在Activin A诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的过程中,干扰SMAD2 后48 h时才检测到Brachyury强表达,而单纯Activin A处理组24 h就检测到强表达;Sox17的表达始终较单纯Activin A处理组明显降低,因此,干扰SMAD2直接抑制了Activin A的诱导作用。而过表达SMAD2,Brachyury和Sox17的表达水平较单纯Activin A处理组明显增加,促进了限定性内胚层的发生;并且在Activin A诱导过程中,p-SMAD2的表达水平明显提高,而SMAD2的表达没有明显改变。【结论】SMAD2作为关键因子,介导了Activin A诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层的分化,并转录调控Brachyury和Sox17的表达;SMAD2的磷酸化,激活并介导了Activin A诱导的信号转导通路。     

Wnt3a和Activin A共同促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化

【目的】研究Wnt3a和Activin A在限定性内胚层诱导中共同作用的最佳时间窗。【方法】在无饲养层体系培养的人胚胎干细胞中,加入25 ng/mL Wnt3a和100 ng/mL Activin A,共同作用不同时间(1~4 d),收集不同作用时间点(0,1,2,3,4,5 d)细胞,对原条、内中胚层前体标记Brachyury及限定性内胚层标记Sox17分别进行免疫荧光染色,统计阳性细胞总数,计算阳性细胞率。以看家基因β-actin作为对照,采用RT-PCR方法对原肠作用基因(Goosecoid(GSC)、Mixl1)及三胚层发育相关基因(内胚层基因Sox17、Foxa2,内中胚层前体基因Brachyury,中胚层基因Flk-1,外胚层基因Pax6,胚外内胚层基因Sox7、CDX2)的表达进行检测。【结果】Wnt3a与Activin A共同作用1~4 d,均能获得限定性内胚层细胞,其中二者共同作用1 d分别能获得(78.9±7.3)%Brachyury阳性细胞和(85.2±3.8)%的Sox17阳性细胞。RT-PCR结果显示,在Wnt3a与Activin A共同作用下,原肠作用基因及三胚层发育相关基因表达的时间有差异。【结论】Wnt3a和Activin A共同作用1 d,是有效促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的最佳作用时间窗。     

草原短尾羊Brachyury蛋白多克隆抗体制备

【目的】克隆草原短尾羊Brachyury基因（即T基因）编码区（CDS）,并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。【方法】提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brachyury基因CDS全长序列连接至pEASY-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,并进行Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB（DE3）大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA（iELISA）法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。【结果】克隆了1 335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。【结论】成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。     

牛优势卵泡膜细胞黄体化相关基因的筛选

【目的】探究牛卵巢小黄体细胞（SLCs）和膜细胞（TCs）中的差异表达基因,进而筛选与TCs黄体化密切相关的基因,为深入研究SLCs、TCs特异性及TCs向SLCs分化的机制提供参考。【方法】利用R软件limma包中的DESeq2,筛选GEO芯片数据库GSE83524数据集TCs和SLCs中的差异表达基因,再用goseq软件对筛选出的差异表达基因进行GO功能富集分析,用 kobas软件进行KEGG信号通路分析,使用String结合Cytoscape软件进行PPI网络互作分析。采集思南黄牛颗粒细胞(GCs)和TCs,以RPLP0作为内参基因,用荧光定量 PCR法对筛选出的与TCs增殖及黄体化相关的基因进行验证。【结果】共筛选获得237个差异表达基因,其中表达上调的基因115个,表达下调的基因122个。GO功能分析结果显示,参与生物学过程的有147个基因,占差异表达基因总数的53.6%,分别富集于30个组;参与细胞组分的有125个基因,占差异表达基因总数的21.4%,分别富集于12个组;参与分子功能的有98个基因,占差异表达基因总数的25.0%,分别富集于14个组。KEGG分析共发现17条通路,其中可能与卵泡内膜细胞黄体化相关的通路为FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1等4个基因参与的卵巢类固醇生成通路。经过PPI网络互作分析,筛选出了前10位的hub基因。荧光定量 PCR分析结果显示,FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B和KIF20A在SLCs和TCs中的转录水平与GEO芯片数据结果一致,表现为FSHR、CYP19A1和CYP17A1在TCs中的表达量极显著高于其在SLCs中的表达量(P<0.01),PLA2G4A、BUB1B和KIF20A在TCs中的表达量亦显著高于其在SLCs中的表达量 (P<0.05)。【结论】差异表达基因FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B和KIF20A在牛优势卵泡TCs增殖分化形成黄体的过程中发挥关键作用。     

丹参C4H基因pET32a原核表达载体的构建

【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因（SmC4H）的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

3种培养体系下人胚胎干细胞神经诱导分化的比较

【目的】比较人胚胎干细胞在人胚胎成纤维细胞、鼠胚胎成纤维细胞饲养层和无饲养层3个诱导体系下形成神经上皮祖细胞的能力。【方法】将人胚胎干细胞在人、鼠胚胎成纤维细胞饲养层或无饲养层体系中诱导10 d后,检测其胚胎干细胞和神经上皮祖细胞相关基因(Oct4、Nestin、Pax6、Sox1、Sox2、Sox3、β-actin)的表达,用免疫荧光染色法检测神经上皮祖细胞抗原标记Pax6、Musashi、Nestin和胚胎干细胞抗原标记SSEA4的表达。【结果】3种诱导体系下均有神经上皮祖细胞形成,均表达神经上皮祖细胞抗原标记Pax6、Musashi、Nestin及Pax6、Nes-tin、Sox家族基因。无饲养层体系诱导后的细胞,Oct4基因的表达高于有饲养层体系;其SSEA4染色阳性细胞比例为(26.3±3.5)%,高于有饲养层体系;其Pax6和Musashi染色阳性细胞比例分别为(81.0±3.0)%,(79.0±4.4)%,均低于有饲养层细胞体系。【结论】人胚胎干细胞在有饲养层和无饲养层体系中均可诱导分化形成神经上皮祖细胞,但无饲养层体系的效率相对较低,且有未分化胚胎干细胞残余。     

Borealin基因在小鼠中的表达

【目的】研究Borealin在小鼠早期胚胎及睾丸中的表达情况,初步探讨Borealin的生物学功能。【方法】利用体外合成RNA探针,采用全胚胎原位杂交检测Borealin基因在9.5～10.5日龄小鼠胚胎中的表达,免疫组化检测Borealin基因在成年小鼠睾丸中的表达,RT-PCR等方法检测Borealin基因在成年小鼠多组织中的表达。【结果】Borealin在小鼠9.5～10.5日龄胚胎的头部和成年小鼠生精小管基底部细胞的部位有较强的表达,在睾丸、卵巢、肠以及眼睛组织中的表达量较其他组织高。【结论】Borealin在小鼠9.5～10.5 日龄胚胎头部及成年小鼠睾丸中均有特异性表达,可能参与了成体干细胞功能的维持。     

大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒（WDSV）辅助基因orfA和orfC多抗的制备及初步应用

【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSV orfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSV orfA和orfC基因。成功构建了orfA和orfC基因的原核表达载体并进行了诱导表达,orfA和orfC重组融合蛋白以包涵体形式存在;采用皮下注射结合耳静脉加强免疫有效地提高了抗体效价,成功制备得到了兔抗orfA和兔抗orfC血清,抗体效价达1∶8 000～1∶10 000;通过Western blot法,利用上述抗血清分别检测到了原核表达的目的蛋白及酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白。【结论】制备得到的抗orfA和抗orfC多克隆抗体具有很好的特异性,能够用于原核表达、酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白的Western blot检测。     

奶山羊IL-6与TGF-β1融合蛋白的制备及其活性检测

【目的】制备具有免疫活性的奶山羊白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）与转移生长因子-β1(Transfer growth factor-β1,TGF-β1)融合蛋白。【方法】采集奶山羊外周血，分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），将PBMCs用刀豆蛋白A（ConA）刺激后提取其总RNA，RT-PCR扩增IL-6与TGF-β1基因，构建其克隆载体及原核表达载体pET-32a TGF-β1和pET-32a-IL-6，然后进行PCR和测序鉴定。将原核表达载体pET-32a-TGF-β1和pET-32a-IL-6转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 中，用 IPTG诱导表达，以镍柱纯化试剂盒纯化IL-6与TGF-β1重组蛋白，对表达产物和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE。用纯化的IL-6、TGF-β1蛋白刺激PBMCs，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因为内参，采用qRT-PCR法检测PBMCs -IL-17 mRNA的表达量。【结果】RT-PCR扩增获得了627 bp的IL-6基因片段和1 137 bp的TGF-β1基因片段，成功构建了IL-6和TGF-β1基因的克隆载体及pET-32a-TGF-β1和pET-32a-IL-6原核表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到成功表达；获得了纯化的奶山羊IL-6与TGF-β1融合蛋白，该融合蛋白联合刺激能使PBMCs的IL-17 mRNA表达水平显著升高。【结论】获得了具有免疫活性的奶山羊IL-6与TGF-β1重组蛋白。     

黄曲条跳甲JH诱导蛋白基因的克隆与表达分析

【目的】克隆黄曲条跳甲保幼激素诱导蛋白（Juvenile hormone-inducible protein,Ps-jhip-1）基因,并分析其表达特征。【方法】克隆黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,对其进行系统发育分析,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR方法分析Ps-jhip-1基因在黄曲条跳甲不同组织器官及1个生物钟周期内表达量的变化趋势。【结果】成功克隆了Ps-jhip-1全长cDNA,其长度为1 252 bp,开放阅读框为1 230 bp,编码409个氨基酸。Ps-jhip-1基因编码蛋白具有典型的类蛋白激酶C超家族的蛋白功能域,不具备保幼激素膜受体分子的特征。系统发育分析结果表明,Ps-jhip-1与同为鞘翅目昆虫赤拟谷盗的8种JH诱导蛋白基因聚为一支。荧光定量PCR结果表明,Ps-jhip-1基因mRNA在黄曲条跳甲雌雄成虫的多种组织器官中都有表达,其中在触角和头部的表达量相对较高,而在中足和后足的表达量相对较低,约为触角表达量的6%;Ps-jhip-1基因mRNA表达水平在1个生物钟周期内存在4个下调表达时段,但并未表现出明显的节律性特征。【结论】成功克隆了黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,并分析了其在不同组织及1个生物钟周期内表达量的变化。     

兔岩藻糖基转移酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45 ku;表达的重组FUT2蛋白可与His标签抗体发生抗原抗体反应。【结论】成功克隆了兔岩藻糖基转移酶基因,获得了分子质量约为45 ku的FUT2蛋白。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

玉米ZmGAPDH和ZmACTIN的原核表达及抗体制备

【目的】制备玉米三磷酸甘油醛（GAPDH）和肌动球蛋白（ACTIN）的多克隆抗体,检测热激条件下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN的表达,为将ZmGAPDH和ZmACTIN作为非生物胁迫下的内参基因奠定基础。【方法】利用DNAMAN 7对ZmGAPDH和ZmACTIN与不同植物同源蛋白间的氨基酸序列进行比对。通过PCR克隆ZmGAPDH和ZmACTIN的CDS,将其构建到原核表达载体pET-28a中并测序;将重组质粒载体转化大肠杆菌BL21（DE3）和RG2, 用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达;将目的蛋白透析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。利用RT PCR和Western blot检测42 ℃热激不同时间（0,2,4,8 h）下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN mRNA及其蛋白的表达水平。【结果】克隆了ZmGAPDH和ZmACTIN基因的CDS序列,成功构建了原核表达载体pET-28a-ZmGAPDH和pET-28a-ZmACTIN。在大肠杆菌中表达出了玉米ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白,将纯化的蛋白免疫家兔后获得了多抗血清。ZmGAPDH多克隆抗体能清晰检测到4 ng原核表达的ZmGAPDH抗原,ZmACTIN多克隆抗体同样能够清晰检测到4 ng原核表达的ZmACTIN抗原。热激不同时间下玉米B73叶片中的ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白表达水平一致,mRNA丰度稳定不变。【结论】成功制备了ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白多克隆抗体;ZmGAPDH和ZmACTIN可以作为内参基因,用于检测热激条件下目标基因的表达水平。     

猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素（Myostatin,MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞（PK15细胞）,用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

利用转基因番茄表达人成纤维细胞生长因子21(FGF21)

【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21（Fibroblast growth factor-21,FGF21）,为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因（pmi）作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ（简写为p1390RⅡ）上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)“中蔬6号”,采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。