Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达.     

秦川牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)N端序列的原核表达及纯化

为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能,探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因,本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列,并将其克隆到pMD18-T simple载体,酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体,命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp1-N融合蛋白表达,并筛选最佳诱导条件,用谷胱甘肽Sepharose4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,牛Nramp1N端编码序列长186bp,与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异,致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1N端表达重组质粒pGEX-N2,于35℃、0.1mmol/LIPTG、诱导10h,在大肠杆菌中高效表达,表达产物的分子量为33kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。     

牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

大肠杆菌yqhD基因的克隆与表达

以大肠杆菌E scherich ia coli K-12基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到假定的氧化还原酶(pu tative ox idoreductase)基因yqhD,将它连接到克隆质粒pGEM-3zf(+)上,得到重组质粒pGEM-yqhD,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,yqhD基因全长为1 164 bp。再将yqhD基因插入表达载体pSE 380,构建成重组子pSE 380-yqhD,并在E.coli BL 21中获得表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在30°C下,以1.0 mm o l/L IPTG诱导12 h的酶活力达到3.13 U/mL,比对照菌株提高4.4倍。     

地衣芽孢杆菌GXN151的纤维素酶基因cel12A的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

地衣芽孢杆菌菌株GXNl51的cell2A基因为783bp,可编码含261个氨基酸的羧甲基纤维素酶Cel12A,Cel12A的N-末端第1～28氨基酸具典型的信号肽特征、第9～31氨基酸具跨膜功能域特征、第104～261氨基酸形成家族12糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。将编码其第73-261氨基酸的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET一30a( )得表达质粒pGXNl2A,用1mmol／IPTG诱导处理JMl09(DE3)／pGXNl2A的培养液6h pGXNl2A的表达量达到最高,在JMl09(DE3)和BL21(DE3)pLysS中该表达蛋白质可分别占菌体胞内总蛋白的54．3％和20．9％。在含羧甲基纤维素的LA平板上JMl09(DE3)／pGXNl2A和BL21(DE3)pLysS／pGXNl2A表现有较弱的羧甲基纤维素酶活性,说明重组的Cell2A的催化功能域具有独立的催化活性。包含体检测表明pGXNl2A在JMl09(DE3)中的表达产物大部分形成不溶性包含体。     

des-pGLU1-Bra基因的人工合成及其在大肠杆菌中的重组表达

根据从西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillion果实中分离的甜蛋白Brazzein的成熟区氨基酸序列，按照大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好人工合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列，经连接和PCR扩增后得到了179bp的Brazzein类似物的编码序列，插入pET30a载体构建成重组表达载体pET-Bra。诱导表达后得到了与预计分子量相同的蛋白，约占细菌可溶性蛋白的12．8％，分离纯化的des-pGLU1-Brazzein甜度约是同等重量蔗糖的600倍。     

抗真菌鲎素基因在大肠杆菌中的表达

人工设计并合成了抗真菌多肽鲎素基因,将合成的鲎素基因首先克隆到了ｐＵＣ１８载体上,利用通用引物测序,获得了与预期碱基序列完全一致的目的基因。再将鲎素基因克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１上,诱导表达融合蛋白。经ＩＰＴＧ诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行检测,在２９ｋＤ处出现了ＧＳＴ－鲎素融合蛋白条带,与预期分子量大小相     

胸腺素家族多肽在大肠杆菌中的表达

为提高胸腺素(又名胸腺肽,thymosin)的体外表达效率,本研究采用设计融合标签的方法对胸腺素α1和β4(Tα1,Tβ4)进行体外重组表达,通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(LC/MS)法,对融合蛋白的完整分子量进行验证,利用反相超高效液相色谱法对不同表达载体的单位表达量进行测定.结果 表明,A 18-KEKE、...     

牛nanog基原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛(Bos taurus)原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEx-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanog基因编码序列.重组质粒转化大肠杆菌JM109(Escherichia coli),在不同的培养温度(25、30和37℃)和不同浓度的IPTG(0.10、0.25、0.50、1.00和2.00mmol/L)诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白.     

牛Nanog 原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究的目的是构建牛Nanog基因原核表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导其表达。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增Nanog 基因,将其克隆到PMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片断,定向克隆到 pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG -Nanog ,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛Nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109, 在不同的培养温度和不同浓度的IPTG诱导下均获得了高效表达,说明培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western Blotting 检测证实该蛋白约60KD, 大小合适,具有GST抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog 蛋白。     

猫白介素-18基因的分子克隆、序列分析及其表达研究

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因（IL-18）序列，对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞（PBMCf）进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18，进行核苷酸序列测定，并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp，编码192个氨基酸。在推导的猫IL-18氨基酸序列中，无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点，但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比，猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸和推导的氨基酸序列有较高的同源性，与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将pTIL-18双酶切，回收目的基因片段亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18，转化大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG进行了诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为27.5 kDa的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描，目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

绿色荧光蛋白与黄瓜花叶病毒运动蛋白融合基因的构建及在大肠杆菌中的表达

采用重组－PCR方法，扩增获得绿色荧光蛋白（GFP）与黄瓜花叶病毒运动蛋白（CMV MP）融合基因，将其克隆到pKEN上，构建了该融合基因的原核表达载体pKENG-M。SDS－PAGE及免疫印迹分析显示，57kD的融合蛋白基因在大肠杆菌DH5α中正确表达，激光共聚焦显微镜分析表明，在488nm光激发下，菌体呈亮绿色，表明融合蛋白保持绿色荧光特性。实验结果为进一步研究CMV MP的功能及其与胞间连丝和其他细胞成分的作用关系奠定了基础。     

鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。     

杆状病毒J 结构域蛋白基因的克隆、表达和抗体的制备

摘要：斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）bjdp (baculovirus J domain protein) 基因是杆状病毒基因组中唯一编码J 结构域蛋白的基因。利用PCR方法扩增得到此全长基因，将其克隆到5'端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上并转化E. coli M15[pREP4]， 在IPTG诱导下表达了一个分子量为36 kD的融合蛋白。以纯化过的6×His-BJDP融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，得到该蛋白的抗血清。免疫印迹分析表明，该抗血清能与感染斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。     

Overlap PCR克隆黄牛脂肪特异性磷脂酶A2基因(AdPLA)及其原核表达

脂肪特异性磷脂酶A2基因(adipose-specific phospholipase A2,A dPLA)在脂肪组织甘油三酯水解过程中发挥着重要的调节作用,为了构建黄牛AdPLA基因原核表达系统,本研究通过Overlap PCR方法从黄牛(Bos taurus)基因组DNA中得到了AdPLA基因编码区全长,将其克隆到pGM-T载体上,阳性克隆经测序表明,与NCBI公布的序列(GenBank No.NM_001075280)完全一致.阳性质粒经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后,将其定向重组到pET28a(+)原核表达载体上,转化感受态大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中,用IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白His-AdPLA在大肠杆菌中表达,证明成功构建了AdPLA基因原核表达系统,为进一步研究黄牛AdPLA基因的功能和AdPLA蛋白产品开发提供了依据.     

用聚合酶链式反应检测猪源大肠杆菌卡那霉素耐药基因

根据编码卡那霉素抗性的磷酸转移酶「ＡＰＨ（３′）－ＩＩ」钝化酶基因的核苷酸序列,设计合成一对引物ＰＩ和Ｐ２,用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术对２６株猪源大肠杆菌临床分离株的卡那霉炮酸转移酶「ＡＰＨ（３′）－ＩＩ」钝化酶基因进行了检测。结果表明,该引物对１４株分离菌株均能扩增出预期的５７８ｂｐ大小的ＰＣＲ产物,与药敏试验的阳性符合率为９３．２％。进一步用限制性内切酶进行酶切分析,发现所有ＰＣＲ产物均出     

玫瑰黄链霉菌几丁质酶基因的克隆及拼接表达

应用PCR扩增克隆到玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的几丁质酶基因chiC的整个催化域部分,将其与包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的链霉菌(S.lividans)chiC基因片段相连接,插入pET23b( )质粒上,构建表达载体pLCH,用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(DE3),转化子进行破壁之后在胶体几丁质酶培养基上表现活性。     

猪干扰素γcDNA的分子克隆与在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR技术从猪脾淋巴细胞总RNA中扩增出猪干扰素γcDNA(SwIFN-γ2).SwIFN-γ2与已报道的猪干扰素γ序列基本一致,仅在462位核苷酸处发生了点变异.在SwIFN-γ2成熟蛋白基因两端分别合成含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到pQE30表达载体,转化宿主菌SG13009(pREP4),经IPTG诱导表达了N'端含6个组氨酸的重组猪干扰素γ(6His-rSwIFNγ2).重组干扰素的表达量占总菌体蛋白的33.5%.采用Ni-NTA金属螯合亲和层析纯化6His-rSwIFNγ2,其纯度达90%以上,经8 mol/L尿素溶液变性、透析复性后,其抗滤泡性口炎病毒比活性为8×103～1.6×104U/mg.