用VP7—ELISA检测牛,羊血清蓝舌病抗体的研究Ⅰ：VP7—ELISA检测蓝舌病抗体方

将表达有蓝舌病毒ＶＰ７蛋白的Ｓｆ２１细胞超声波处理制备ＶＰ７抗原,建立了ＶＰ７－ＥＬＩＳＡ检测蓝舌病抗体的方法,确定阴性阳性判定界值及最佳反应条件：待检牛血清阳性下限为３．０,羊血清阳性下限为２．４,ＶＰ７抗原包被浓度为１：８００,用含５％健康鸡血清的磷酸盐缓冲液作封闭液,待检血清１：１００稀释,豚鼠抗牛羊ＩｇＧ－ＨＲＰ结合物１：５００稀释,３７℃避免显色４ｍｉｎ～６ｍｉｎ。试验结果表明：ＶＰ７可与２３个不同血清型ＢＴＶ抗体反应,具有较高的群特异性和敏感性。     

VP_7-ELISA检测牛、羊血清蓝舌病抗体的研究Ⅱ应用VP_7-ELISA检测蓝舌病抗体

蓝舌病ＶＰ７抗原包被板在－２０℃保存期为６个月,４℃保存１个月。抗原批内重复性试验ＣＶ＜１０％,批间重复性试验ＣＶ＜１０％。ＶＰ７－ＥＬＩＳＡ与ＡＧＩＤ对４２０份血清平行检测结果：ＶＰ７－ＥＬＩＳＡ较ＡＧＩＤ试验多检出了 １３份阳性样品, ＶＰ,－ＥＬＩＳＡ检出的阳性样品对ＡＧＩＤ阳性样品的覆盖率为９７．４％,对采自陕西等省１８１６份牛、羊血清样品进行检测,检出阳性样品数为２５７份阳性检出率为１４．２％。     

14型蓝舌病病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。     

竞争酶联免疫吸附试验检测蓝舌病抗体的研究

用已研制的BTV－11型VP7单克隆抗体建立了竞争酶联免疫吸附试验（C－ELISA）检测蓝舌病抗体的方法，并与琼脂免疫扩散试验（AGID）进行了检测比较，C－ELISA特异性强，不与相关环状病毒发生交叉反应，敏感性比AGID高。用研究制备的C－ELISA诊断试剂盒和美国、澳大利亚制备的诊断试剂盒对1377份临床样品的检测，以及对实验动物人工感染后抗体动脉检测。三种诊断试剂盒检测结果一致，且重复性好。本研究建立的蓝舌病C－ELISA是一种特异性强、敏感性高的蓝舌病抗体检测方法。     

蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。     

蓝舌病病毒VP7基因的原核表达

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7.将重组质粒转化TBl感受态细胞,以0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90 ku.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础.     

2种蓝舌病ELISA抗体检测试剂盒的比较和分析

为了验证云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心自主研发的蓝舌病病毒C-ELISA抗体检测试剂盒(YN BTV C-ELISA)的可应用性,将YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒与美国IDEXX公司研制的蓝舌病病毒VP7蛋白抗体ELISA检测试剂盒对田间牛羊的1 028份血清样本进行对比检测试验,并使用YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒对15份检出的已知背景血清进行批内和批间可重复性试验。YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒相对IDEXX公司蓝舌病病毒ELISA抗体试剂盒的符合率、敏感性、特异性分别是98.44%、98.03%、98.85%,两者一致性用Kappa值表示,Kappa=0.97。批内试验强阳性、弱阳性变异系数在0.23~1.81之间,阴性血清变异系数在3.94~6.64之间,批间试验强阳性、弱阳性变异系数在0.26~2.35之间,阴性血清变异系数在3.55~8.51之间。结果表明:YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒的符合率、敏感性、特异性均较高,具有高度的可靠性、一致性和真实性。YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒的批内和批间有高度的重复性,在蓝舌病的诊断中具有良好的实用价值。     

抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。同时,IFA鉴定结果进一步表明,3株MAb与24个血清型的BTV均可以发生反应。本研究制备的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

2022年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南省边境地区牛蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）与阿卡斑病毒（Akabane virus,AKAV）的流行与分布现状,2022年在云南省9个边境县（市）采集1 820份牛血清样本,应用c ELISA方法进行BTV与AKAV抗体检测,并对检测结果利用IBM SPSS Statistics 22、Excel 2007等软件进行区间、群间和时间的分类统计分析。结果显示：共检出BTV阳性样品1 207份,样品阳性率为66.32%(1 207/1 820);检出AKAV阳性样品350份,样品阳性率为32.17%(350/1 088)。各县（市、区）的BTV样品阳性率为43.50%～93.00%,AKAV为12.90%～50.00%,不同地区间的差异有统计学意义（P <0.01）;黄牛和西门塔尔牛的BTV和AKAV抗体样品阳性率均高于水牛,入境牛BTV抗体阳性率显著高于本土牛,两组数据差异均有统计学意义（P <0.01）;规模养殖场的BTV和AKAV抗体阳性率和散养户差异无统计学意义（P> 0.05）;7—8月的BTV和AKAV抗体阳性率显著高于5—6...