重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究Ⅱ.试剂盒阴阳性临界值的测定及其与IDEXX公司试剂盒的比较

对临床上采集的899份猪血清样本。用以纯化的重组N蛋白为包被抗原建立的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体的间接ELISA进行检测．运用统计学方法摸清了检测结果的分布规律。并扣国外IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒同时对460份血清样本进行检测。结果表明。2种方法的符合率为91．73％。利用TG—ROC软件确定了自制的ELISA酶标板（NP—ELISA）的临界值。并标定试剂盒的特异性扣敏感性均为92．6％。ELISA的结果判定标准是：当以血清样本L为标准参考阳性血清时，样品与阳性血清的比值（S／P）小于或等于0．4为阴性；S／P在0．4与0．5之间为可疑；S／P大于或等于0．5为阳性。与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒对临床样品的检测结果进行比较后，初步判定所建立的ELISA之所以出现较多的假阴性。可能是目前临床上出现了PRRSV欧洲型所致。     

禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法.该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性.与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P＞O.17为阳性判定标准.应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%.     

两种PCV2抗体ELISA检测试剂盒检测效果比较

为研究比较国内市售两种PCV2抗体ELISA检测试剂盒(ZJ-ELISA、HB-ELISA)的检测效果,以期为猪群PCV2抗体监测选择试剂盒提供参考。首先通过间接免疫荧光方法(IFA)测定44份猪血清的PCV2抗体滴度,并以此为标准,判定猪血清中PCV2抗体的阴阳性,然后利用两种PCV2抗体ELISA检测试剂盒分别测定上述血清的OD值,并判定PCV2抗体阴阳性。通过计算各种试剂盒检测结果与IFA检测结果的符合率以及配对卡方检验及Kappa检验,判定最优检测试剂盒。结果表明,国内市售两种PCV2抗体检测试剂盒与IFA检测结果的总符合率均为86.36%(38/44),配对卡方检验及Kappa检验表明国产试剂盒与IFA检测结果差异不显著。     

3种ELISA试剂盒检测猪伪狂犬病gE抗体的比较

通过对猪伪狂犬病毒gE抗体的3种ELISA试剂盒比较试验数据分析,3种试剂盒检测值均呈极显著的相关关系(P<0.01)。检测定性结果一致程度较高,其中HIPRA与IDEXX一致性强度为极强(Kappa=0.808),且其符合率达89.4%;HIPRA与LSI、LSI与IDEXX均为高度一致(Kappa=0.732、0.724),且其符合率依次为85.6%、85.3%。经gE抗体阳性率检测结果统计学检验,3种试剂盒gE抗体阳性率之间差异均不显著(P>0.05),其检测灵敏度从高到低次序为LSI、IDEXX和HIPRA。临床应用数据分析表明,LSI检测样品存在1.26%假阳性结果,使用LSI检测gE抗体易造成临床猪伪狂犬误诊,为降低误诊率须加大检测群体的样本数或要求有阻断率≥76.73%的样品存在。在临床样品检测群体定性中HIPRA、IDEXX与临床相符率均达100%,LSI与临床相符率为95.5%,其中相符率LSI与HIPRA差异显著(P<0.05)。从猪伪狂犬病净化角度来说,3种试剂盒均可使用,但若用于猪伪狂犬病诊断或了解群体猪伪狂犬病毒野毒感染程度则宜采用HIPRA或IDEXX试剂盒。在实际应用中除选择合适的试剂盒外还应注意检测数据的科学分析。     

ELISA法检测种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒抗体的研究

为研究种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒(REV)抗体的检测方法,运用IDEXX公司的REV抗体ELISA检测试剂盒,比较了不同提取方法、不同稀释倍数、不同洗液对卵黄中REV抗体检测结果的影响。结果显示:当用直接提取的卵黄液做300倍稀释检测,用含0.05%吐温-20的蒸馏水洗涤时,卵黄抗体的S/P比值与相应鸡群的血清抗体的S/P比值吻合度最高。应用本方法分别对50枚SPF种蛋和50枚普通鸡蛋进行检测,SPF种蛋均为REV抗体阴性;普通鸡蛋有4枚为REV抗体阳性,阳性率为8%。实验表明,种蛋卵黄ELISA抗体检测法可以代替传统血清抗体检测,为SPF鸡群的REV感染监测奠定了基础。     

SPF鸡感染禽白血病病毒A/B亚群后血清抗体与卵黄抗体的变化及其相关性

拟研究以卵黄抗体替代血清抗体检测判定SPF鸡群禽白血病病毒(ALV)感染状态的可行性。在人工接种ALV-A/B后的40只SPF鸡刚开产时,从21只抗体阳性鸡及19只抗体阴性鸡分别采集血清和卵黄并一一对应,比较卵黄不同稀释度与血清中ALV-Ab抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。另外36只同批次不攻毒的SPF鸡单独饲养作为对照,76只鸡在25~34周龄期间,每隔3周分别采集1次血清,每周采集1次种蛋,共采集了304份血清样品及836份卵黄样品。所有血清和卵黄抗体用IDEXX的ALV-Ab抗体ELISA检测试剂盒检测。血清按试剂盒规定的1∶500稀释,卵黄按预试验结果选定稀释度稀释。同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品,严格在同一次ELISA试验中检测。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄做1∶300稀释时,假阳性和假阴性最少,确定1∶300为卵黄最适稀释度。在25~34周龄,836份卵黄抗体的检测判定结果与304份血清抗体检测结果吻合率达94.7%,即这些血清抗体阳性鸡同时期采集的卵黄抗体也全部阳性,血清阴性鸡的卵黄抗体也均为阴性。结果提示疫苗生产企业可通过检测SPF种蛋的卵黄抗体来判断SPF鸡场对ALV的洁净度。     

两种猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒对疫苗免疫猪血清抗体检测的比较试验

为了比较两种猪瘟病毒抗体检测试剂盒对猪瘟疫苗免疫抗体的检测结果,本试验将27头猪瘟抗体阴性仔猪免疫猪瘟活疫苗后7、10、14、17、20、23、27、30、34 d共9个时间点采血,分别用两种猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测,同时采用OIE指定方法-荧光抗体病毒中和试验对检测结果进行验证。结果表明,虽然两种试剂盒均可在免疫后30 d 100%检测到免疫猪体内的猪瘟抗体,但国产试剂盒在疫苗免疫后第10天便可在6/21猪体内检测到猪瘟抗体,20 d时抗体检测全为阳性,而美国IDEXX公司的试剂盒在疫苗免疫后27 d才在11/21猪体内检测到猪瘟抗体,30 d时才全部变为阳性,而两种试剂盒对6头阴性对照猪血清连续跟踪检测34 d均为阴性。由此可以得出结论:国产试剂盒在疫苗免疫后的早期抗体检测中敏感性明显高于IDEXX公司的试剂盒。     

对鸡群A/B亚群禽白血病病毒抗体ELISA检测阳性率的可靠性评估

为了评估某些批次的禽白血病病毒（ALV）抗体商品化 ELISA检测试剂盒在检测鸡群中A/B亚群禽白血病病毒（ALV-A/B）抗体阳性率的可靠性,使用同一批次试剂盒,对往年ALV-A/B抗体检测阳性率达标（＜1%）的A类鸡场及往年ALV-A/B抗体检测阳性率不达标（＞1%）的B类鸡场所送检样品进行初检,在A类鸡场初检阳性样品中挑选S/P值最高的8份阳性样品,在B类鸡场初检阳性样品中挑选S/P值最高的40份样品,再使用相同批次的试剂盒将每个初检阳性样品做3个孔的重复检测,并以上述48份样品为一抗同时做间接免疫荧光试验（IFA）,系统比较了IFA和ELISA 2种方法检测结果的一致性。结果发现,A类鸡场初检为阳性的8份样品经复检和IFA检测均变为阴性;B类鸡场4份样品（4/40）ELISA复检和IFA结果均变为阴性,36份样品（36/40）ELISA复检仍为阳性,但其中20份呈IFA阳性,16份呈IFA阴性,结果表明某些批次的试剂盒在特异性和稳定性方面存在一定问题。提示,相关企业在进行大批量样本检测时,ELISA阳性样品需结合IFA进行结果判定,以提高检测的准确性。     

检测猪瘟病毒E0抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

应用RT-PCR技术扩增了猪瘟病毒的E0基因片段,并将其分别克隆到pGEX-4T-1与pET-28a载体,获得了pGEX-4T-1-E0与pET-28a-E0重组表达质粒。以IPTG诱导表达的纯化GST-E0和His-E0重组蛋白为包被抗原,建立检测猪瘟病毒E0抗体的间接ELISA方法。采用方阵滴定法,确定出GST-E0抗原和His-E0抗原的最佳包被量分别为50 ng/孔和100 ng/孔,血清最佳稀释度为160倍。对80份猪瘟阴性血清样品进行了检测与统计学分析,确定出GST-E0和His-E0重组蛋白的间接ELISA方法的临界值分别为0.167和0.176。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,本试验建立的基于GST-E0和His-E0蛋白的间接ELISA方法均具有特异、敏感和重复性好等优点。应用GST-E0和His-E0的间接ELISA方法及IDEXX E2抗体检测试剂盒平行检测88份猪血清样品,结果显示基于GST-E0和His-E0的间接ELISA方法与IDEXX试剂盒的符合率分别为78.41%和84.09%。以猪瘟病毒接毒细胞为抗原,应用免疫荧光试验(IFA)对His-E0间接ELISA和IDEXX检测试剂盒检出的阴性与阳性血清样品进行了验证,结果IFA与His-E0间接ELISA方法的符合率为93.18%;IFA与IDEXX试剂盒的符合率为90.91%,表明本试验所建立的基于His-E0的间接ELISA方法用于检测猪瘟抗体优于IDEXX公司检测E2抗体的试剂盒。该方法为鉴别E2亚单位疫苗免疫后的猪群中是否存在野毒感染提供了技术手段。     

检测猪伪狂犬病抗体的3种ELISA试剂盒的比较分析

为评价用于检测猪伪狂犬病抗体的3种商用的试剂盒,择优选取一种作为本中心的检测试剂。用3种试剂盒检测386份免疫背景清楚的临床及试验血清,比较各试剂盒的检测阳性率、敏感性。结果386份血清经HIPRA、LSI和IDEXX试剂盒检测,检测阳性率分别为30.83%、59.84%和71.24%,且3种试剂盒相同血清的检测阳性率相互间差异均极显著性(P<0.01),但是对于高抗体水平的38份母猪血清检测阳性率相互间差异均不显著(P>0.05)。检测数据表明IDEXX与LSI两者相关系数为-0.941,检测定性完全相符率达81.12%。结果3种试剂盒检测阳性率、敏感性均以IDEXX为最高,LSI次之,HIPRA最低;IDEXX与LSI两者呈现强相关,造成阳性检测率差异显著的主要因素是方法的敏感性、试验结果的判定标准。     

2种蓝舌病ELISA抗体检测试剂盒的比较和分析

为了验证云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心自主研发的蓝舌病病毒C-ELISA抗体检测试剂盒(YN BTV C-ELISA)的可应用性,将YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒与美国IDEXX公司研制的蓝舌病病毒VP7蛋白抗体ELISA检测试剂盒对田间牛羊的1 028份血清样本进行对比检测试验,并使用YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒对15份检出的已知背景血清进行批内和批间可重复性试验。YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒相对IDEXX公司蓝舌病病毒ELISA抗体试剂盒的符合率、敏感性、特异性分别是98.44%、98.03%、98.85%,两者一致性用Kappa值表示,Kappa=0.97。批内试验强阳性、弱阳性变异系数在0.23~1.81之间,阴性血清变异系数在3.94~6.64之间,批间试验强阳性、弱阳性变异系数在0.26~2.35之间,阴性血清变异系数在3.55~8.51之间。结果表明:YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒的符合率、敏感性、特异性均较高,具有高度的可靠性、一致性和真实性。YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒的批内和批间有高度的重复性,在蓝舌病的诊断中具有良好的实用价值。     

鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

建立了一种检测鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)抗体终点滴度(end-point titer, ET)的间接ELISA方法，以应用于监测鸡免疫疫苗或者感染野毒后的抗体。以大肠杆菌表达的IBV核衣壳(N)蛋白作为包被抗原，以SPF鸡血清和感染IBV的SPF鸡血清分别作为阴性血清和阳性血清对照，优化确定出ELISA的各项技术参数。对66份SPF鸡血清进行测试，确定了阴、阳性S/P临界值为0.385。特异性试验表明包被抗原与其他常见病原的阳性血清均不发生交叉反应，批内和批间重复性试验的变异系数均小于10.00%。选取了50份临床血清样品，通过阳性-阴性阈值(positive negative threshold, PNT)基线确定ET值，建立了固定血清稀释倍数(1∶500)处S/P值与ET的线性回归方程，相关系数(R²)为0.959 3(P<0.000 1)。通过检测2个商品鸡群在1～49日龄不同时间点采集的461份血清样本，比较了建立的IBVN-ELISA方法与IDEXX公司提供的商品化试剂盒。本研究建立的I...     

利用重组E2蛋白检测BVDV血清抗体间接Dot-ELISA方法的建立

利用大肠杆菌表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白作为抗原,建立了检测BVDV血清抗体的间接Dot-ELISA.最佳工作条件为:E2蛋白抗原的最适包被质量浓度2.0 mg/L(2.0 ng/点),酶标抗体的工作浓度为1:500,血清稀释度为1:100,3%明胶-TBS作为封闭液,封闭45 min效果最佳.通过重复性试验、交叉试验、特异性试验和稳定性试验等证明,该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;与用BVDV全病毒为抗原的IDEXX ELISA试剂盒相比,特异性96.67%,灵敏度90%,符合率95%.应用建立的检测方法对河北省4个奶牛场采集的178份腹泻奶牛血清样本进行检测,结果BVDV血清抗体阳性率40.45%,与IDEXX ELISA试剂盒的检出率无明显差异.     

SPF鸡感染J亚群禽白血病病毒血清抗体与卵黄抗体的变化动态及其相关性

为研究以卵黄抗体替代血清抗体判定SPF鸡群J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染状态的可行性,人工接种ALV-J的SPF鸡23周龄时,分别从25只抗体阳性鸡及22只抗体阴性鸡采集血清和卵黄,比较不同稀释度的卵黄与血清中ALV-J抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄1∶400稀释,假阳性和假阴性最少,确定1∶400为卵黄最适稀释度。对40只攻毒SPF鸡和36只同批次单独饲养的空白SPF鸡在25~34周龄,每隔3周采集一次血清,每周采集一次种蛋,共采集304份血清样品和760份卵黄样品。血清按1∶500稀释,卵黄按1∶400稀释,所有血清和卵黄抗体用美国IDEXX公司ALV-J抗体ELISA检测试剂盒检测,同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品严格在同一次ELISA中检测。结果显示,在25~34周龄,卵黄抗体检测判定结果与血清整体吻合率为82.5%~95%。上述结果表明用卵黄抗体替代血清样品检测来监控SPF鸡群对ALV-J的感染状态是可行的,疫苗生产企业可通过抽检SPF鸡场提供SPF种蛋的卵黄抗体水平来判断SPF鸡场的洁净度。     

猪瘟病毒5种ELISA抗体检测试剂盒的比较

[目的]比较猪瘟病毒（CSFV）5种ELISA抗体检测试剂盒的使用效果。[方法]利用细胞中和试验制备的标准质控血清,制备不同猪瘟抗体效价的阳性血清70份和阴性血清20份,对5种试剂盒的敏感性、特异性和符合率进行比较。利用该5种试剂盒对不同年龄段猪群血清中猪瘟抗体水平进行检测。[结果] 5种试剂盒的敏感性为85.7%-100%,特异性均达到100%,符合率为88.9%-100%。不同年龄段猪血清样品中,5种试剂盒检测结果不尽相同。[结论]猪瘟抗体效价的高低对5种试剂盒检测结果的一致性有一定影响,尤其是针对弱阳性样品时,IDEXX猪瘟抗体试剂盒和荷兰赛迪公司的猪瘟抗体试剂盒检测效果相对较好,为猪瘟免疫检测工作提供了一定依据。     

猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

竞争ELISA检测猪呼吸与繁殖综合征病毒抗体研究

应用抗PRRSN蛋的单克隆抗体建立了竞争ELISA检测技术,与美国IDEXX公司的间接ELISA检测试剂盒对比检测了30份SPF猪血清,29头SPF猪人工接种呼吸与繁殖综合征病毒后于5d、12d、29d采集的猪血清共87份,临床血清95份,以及其他相关病毒的阳性血清。实验证明,竞争ELISA的检测阴阳性限值为30%,检测特异性为100%,在人工攻PRRSV病毒第五天的猪血清中,可检测到抗PRRSVN蛋白抗体,12dpi,阳性检出率为93%,29dpi,阳性检出率为100%,与IDEXXPRRSVELISA试剂盒进行比对,结果表明,二种检测方法检测美洲株PRRSV抗体的符合率为90%以上,但检测欧洲株抗体符合率较低。建立的竞争ELISA检测技术对于PRRSV美洲株抗体的早期诊断有非常重要的意义。     

IHA与ELISA检测猪瘟病毒抗体的比较

应用间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪瘟病毒抗体,IHA试验以1∶16为判定孔,抗体效价大于或等于1∶16为抗体阳性;ELISA试验以抗体阻断率40%为判定标准,阻断率大于或等于40%为抗体阳性,同步检测了122份规模化猪场不同阶段免疫猪血清.结果ELISA检测抗体阳性率比IHA检测抗体阳性率低,阴性、阳性相符的血清数为92份,相关性为 75.4%,不同抗体水平分布的血清数也不同,个别血清出现较大差异,卡方检验P值为0.13(＞0.05),两种检测方法统计上无差异,研究结果为选择猪瘟病毒抗体检测方法提供参考.     

山东省部分地区猪繁殖与呼吸综合征的血清学调查

应用ELISA方法对山东省部分地区猪群的猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)流行情况进行初步的血清学调查。结果表明 ,在调查的 61个猪场中 ,PRRS阳性猪场 46个 ,占 75 4%。检测血清 2 1 70份 ,其中阳性 1 4 0 6份 ,阳性率 64 8%。分别用 2种不同ELISA试剂盒检测同组血清样品 ,结果显示本诊断中心建立的PRRSELISA试剂盒与IDEXX公司生产的ELISA试剂盒的符合率为 94 3 %。     

小鼠肝炎病毒抗体ELISA和IFA检测试剂盒真实性评价

为评价小鼠肝炎病毒(MHV)抗体ELISA和IFA检测试剂盒的真实性,选择两种进口MHV抗体ELISA和IFA试剂盒检测26份小鼠血清,并对检测结果进行对比评价。检测结果显示,26份血清中,13份两种试剂盒检测的结果全为阳性,11份全为阴性,剩余2份分别为ELISA阳性、IFA阴性。评价结果显示,参比IFA,ELISA试剂盒灵敏度为100%,特异度为84.61%,误诊率为15.38%,漏诊率为0,准确度为92.30%,正确指数为0.846,阳性似然比为650%,阴性似然比为0。结果初步证实,ELISA试剂盒配合IFA试剂盒适用于MHV抗体的日常监测。