一步法RT-PCR快速检测猪瘟活疫苗中BVDV外源病毒方法的建立

为检测商品化猪瘟细胞毒活疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染,根据牛病毒性腹泻病毒5′端非编码区基因保守序列设计引物,建立了检测牛病毒性腹泻病毒一步法反转录—聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对牛病毒性腹泻病毒扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性,对牛病毒性腹泻病毒检测的灵敏性为1pg总RNA量,应用该方法,检测了32批猪瘟细胞毒活疫苗样品,以上结果表明该一步法RT-PCR方法检测速度快、特异性强、敏感性高,可用于猪瘟细胞毒活疫苗中污染的牛病毒性腹泻病毒外源病毒检测。     

猪瘟脾淋毒活疫苗中兔瘟外源病毒检测方法的建立及应用

为检测商品化猪瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染,根据兔出血症病毒VP60基因保守序列设计引物,建立了检测兔出血症病毒一步法反转录一聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对RHDV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对兔出血症病毒检测的灵敏性为10皮克总RNA量,应用该方法,检测了20批猪瘟脾淋源活疫苗样品,以上结果表明该一步法RT-PCR方法检测     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻/粘膜病病毒5'端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/粘膜病病毒244 bp片段的RT-PCR一步法。该方法对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒NADL、OregonC24V和长春184毒株各标准毒株检测,结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。检测460份不同样品,与病毒分离试验比较,符合率100%,证明该方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的一步法RT-PCR技术可用于牛病毒性腹泻/粘膜病的检测及流行病学调查。     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

基于Erns基因的猪瘟病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪瘟病毒Erns基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪瘟病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对CSFV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪瘟病毒检测的灵敏性为10 pg总RNA量。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

延边黄牛BVDV一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立延边黄牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的一步法RT-PCR检测方法,根据Gen Bank上已登录的BVDV基因序列,应用Oligo 6.0设计一对特异性引物,建立BVDV的一步法RT-PCR检测方法,并将该方法应用于临床检测。结果显示,该方法对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因扩增均为阴性,敏感性为1 ng基因组RNA,具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于延边黄牛BVDV感染的早期诊断和病原体监测。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了BVDV的RT-PCR检测方法。该方法从BVDV标准毒株NADL中扩增出了279bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞等的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1×TCID50。提取9份细胞毒总RNA后,进行一步法RT-PCR扩增可获得一致的检测结果,说明该方法重复性很好。应用该方法对45份临床疑似患牛的样品进行检测,结果检出4份阳性,表明该方法具有较好的临床应用性,且检测结果与参考实验室检测结果完全相符,可用于BVDV的快速诊断。     

一步法 RT-PCR 快速检测猪流行性腹泻病毒

对猪流行性腹泻病毒N基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪流行性腹泻病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对猪流行性腹泻病毒（PEDV）扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪流行性腹泻病毒检测的灵敏性为100 pg总RNA量。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪流行性腹泻的早期确诊和病毒鉴定。     

猪瘟疫苗中BVDV污染一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪瘟(CSF)疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染的方法,试验根据GenBank上登录的BVDV 5'端非编码区基因组序列设计1对引物,经一步法RT-PCR反应条件的优化,建立了检测猪瘟疫苗中BVDV污染的一步法RT-PCR。结果表明:该方法对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV基因组RNA的检测灵敏度达0.1 ng,与细胞培养法的符合率达100%。应用该方法对猪瘟疫苗、牛血清等138份样品进行BVDV污染的检测,阳性污染率达11.59%。该一步法RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、准确性和适用性,可用于猪瘟疫苗生产中血清、细胞、毒种、半成品等的质量控制及猪瘟疫苗临床应用中的质量检验。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出471 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10^-1 TCID₅₀/mL。应用该方法对临床腹泻病牛各脏器样品进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

牛病毒性腹泻病毒一步法.RT-PCR检测方法的建立及应用

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区基因保守序列设计引物,建立了检测BVDV一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。结果表明,该方法对BVDV检测的灵敏度达到1pg RNA,特异性强、敏感性高,可用于牛病毒性腹泻病的早期确诊和病毒鉴定。     

一步法RT-PCR快速检测禽呼肠孤病毒方法的建立及应用

根据禽呼肠孤病毒(ARV)P10基因保守序列设计了1对引物,建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对ARV扩增结果为阳性,参照毒株扩增结果均为阴性,对禽呼肠孤病毒检测的灵敏性为10pg总RNA。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强敏感性高、简便和快速,可用于禽呼肠孤病毒病的早期确诊和病毒鉴定。     

基于便携式荧光定量PCR仪的猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒现场检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒一步法荧光RT-PCR鉴别检测方法。本研究参照Gen Bank中猪流行性腹泻病毒以及传染性胃肠炎病毒特异性基因序列,设计特异引物和Taq Man探针,通过优化反应条件,建立了检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的一步法荧光RT-PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒灵敏度分别可达0.32 TCID_(50)/100μL和1.58 TCID_(50)/100μL,该法对猪轮状病毒(RV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的Taq Man一步法荧光定量RT-PCR检测方法可对猪流行性腹泻和传染性胃肠炎进行快速诊断,适合现场检测,为猪病毒性腹泻的诊断和防控奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒鉴定及分型RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的RT-PCR方法,并且可以实现在同一体系中对BVDV进行分型。根据GenBank中公布的BVDV基因组序列,针对高度保守的5′UTR区域分别设计鉴定及分型引物,建立牛病毒性腹泻病毒鉴定及分型RT-PCR检测方法。应用鉴定RT-PCR检测方法可从BVDV阳性毒株中扩增出288bp的特异性片段;而分型RT-PCR检测方法可在同一体系中从BVDV1型和2型毒株中扩增出大小分别为316bp和110bp的特异性片段,但对猪瘟病毒、牛副流感3型病毒及牛传染性鼻气管炎病毒等均为阴性,最低可检测出的病毒量分别为1TCID50/mL和10TCID50/mL。临床试验证明,建立的鉴定及分型RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,具有很高的实用价值,为进一步开展流行病学调查、病毒分离等提供可靠的技术手段。     

边界病病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

边界病(border disease)由边界病病毒(border disease virus, BDV)引起,导致绵羊和山羊持续感染和繁殖疾病,2012年在国内首次报道,但目前尚无特异的RT-PCR方法对该病原进行检测。本研究通过比对黄病毒科瘟病毒属病毒的全基因组序列,以3′-UTR基因为靶基因,设计了特异扩增BDV的引物。通过构建重组质粒pMD18-T-BDV,以其作为标准品建立了BDV的RT-PCR检测方法。进一步优化该方法的反应条件,并进行特异性、敏感性及临床样品检测。结果显示,该方法在退火温度48～60℃时均可特异扩增BDV,通过检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)和猪瘟病毒(CSFV)提取的RNA,该方法可特异扩增BDV而对其他同属病毒检测均呈阴性,表明其特异性良好;同时,该方法具有良好的敏感性,最低检出限可达10¹拷贝/μL,敏感性极高。利用该方法检测BDV持续感染羊和人工感染羊,发现持续感染羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、卵巢、脑等器官均可检测到BDV,而人工感染羊只能在感染3～7 d的血液和淋巴结...     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立和初步应用

根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的全基因序列,进行对比分析,分别设计合成两对能特异性扩增CSFV、BVDV的引物。经过条件优化后,建立了检测CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法,扩增两种病毒的片段,大小分别为938、650 bp。应用该方法对11批牛睾丸细胞、7批胎牛血清、60个批次的猪瘟细胞苗、10份全血样及10份组织样进行检测。通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,为防止猪瘟细胞苗的污染及进行CSFV和BVDV鉴别诊断提供了有效方法。     

牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立

建立了能够同时检测牛轮状病毒(BRV)与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的双重RT-PCR方法.应用两对特异性引物进行了双重RT-PCR扩增,这两对引物分别对应于BRV的VP7基因和BVDV的5-UTR中的部分编码序列,其扩增产物分别为342bp和196bp.说明该方法的特异性强、敏感性高,可检测到1pg的病毒RNA,可应用于临床诊断和流行病学研究.     

基于E基因的猪乙型脑炎病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)E基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪乙型脑炎病毒一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对JEV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性,对JEV检测的灵敏性为10 pg总RNA量。以上结果表明该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪乙型脑炎的早期确诊和病毒鉴定。     

BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)3种病毒基因序列,设计引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术,用这3对引物对同一样品中的BVDV、BCV、BRV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果可同时扩增BVDV的466 bp,BCV的685 bp,BRV的247 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型扩增结果均为阴性。敏感性测定表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BRV和10 pg的BCV模板。用45份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,显示两者的总符合率为100%。表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪瘟活疫苗外源病毒BVDV不同检测方法之比较

对于猪瘟细胞活疫苗的外源病毒检测,我国的《中国兽药典》有严格的要求和详细的检测方法,《中国兽药典》规定采用细胞培养法判定外源因子感染情况,应无外源病毒污染。但随着PCR技术的发展,许多农业学校、研究所、兽药监测机构常用PCR方法检测猪瘟细胞活疫苗中的BVDV(牛病毒性腹泻病毒)外源病毒。我们同时采用外源病毒检验的细胞培养法(法定的)和PCR方法(流行的)选用了一些猪瘟细胞苗做了BVDV检测的比较试验,结果显示:细胞培养法除了能检测到BVDV,还可检测蓝舌病病毒、细小病毒,对外源病毒检测更全面;PCR方法经常会有假阳性,如果对阳性结果不做基因测序,可能出现BVDV假阳性的结果,导致结果偏差,我们的试验结果希望引起同行的注意。