用微量细胞培养ELISA测定HCLV TCID_(50)

应用猪瘟兔化弱毒制备的猪瘟兔化疫苗常因为剂量不足而引起免疫失败。究其原因主要是因为兔检(RID)合格的猪瘟兔化苗批间差异较大,质量不稳定。为此建立微量细胞培养ELISA用以测定HCLV TCID50,并获得成功,可以替代RID测毒。     

猪瘟兔化弱毒间接免疫荧光鉴定方法的建立

为快速有效测定猪瘟疫苗病毒含量,建立了猪瘟兔化弱毒(HCLV)间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与兔体定型热试验方法进行了初步比较。试验结果表明,以冷甲醇固定ST细胞,将所选猪瘟活疫苗检验用阳性血清1:40倍稀释、荧光二抗1:32倍稀释时,IFA检测HCLV感染的ST细胞清晰、特异,检测猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒感染细胞阴性。对不同猪瘟疫苗半成品的检测结果显示,IFA测定半数组织感染量(TCID50)与兔体定型热试验测定兔体感染量(RID)具有较好的相关性,其拟合曲线为RID/m L=2.783TCID50/m L+110107.213。     

不同RID猪瘟兔化弱毒细胞苗免疫效果评价

为了比较不同兔体感染剂量(RID)的猪瘟兔化弱毒细胞苗的免疫效果,试验在市场上随机选取A、B两厂家生产的猪瘟兔化弱毒细胞苗(A厂家原代细胞苗12 000 RID、B厂家传代细胞苗30 000 RID)对四川省内江市某种猪场提供的186头20日龄健康仔猪进行免疫,将186头仔猪随机分为6组,每组31头,分别于20日龄、60日龄使用1,2,4头份三个剂量进行首免及加强免疫,并分别于免疫前(20日龄)、50日龄、100日龄采血分离血清,用猪瘟间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体水平。结果表明:以1头份(30 000 RID)B厂家生产的猪瘟传代细胞苗免疫效果最好,其次是A厂家生产的4头份(48 000 RID)原代细胞苗,而1头份(12 000 RID)免疫效果较差。说明猪瘟兔化弱毒细胞苗RID含量在30 000~60 000 RID时免疫效果较好。     

猪瘟预防接种免疫效果研究

猪瘟兔化弱毒疫苗对猪瘟的预防效果,受诸多因素的影响。结果表明,免疫母猪所产亲代仔猪的母源抗体对疫苗注射的抑制免疫明显,选含母源抗体中和价滴度在32以上的仔猪进行1至3头剂量的免疫,等免疫至9个月时,攻击猪瘟石门系强毒,免疫抑制占50%以上,通过加大免疫剂量对仔猪免疫,可排除免疫抑制和免疫耐受障碍。     

提高猪瘟犊牛睾丸细胞苗效价的探索

猪瘟兔化弱毒可以在犊牛睾丸细胞内不断复制，并以出立式释放至培养液中，而不致细胞病变，在几年的生产中，我们通过合理调整影响细胞产毒的各 使收获的细胞毒的兔体反应量由稀释５万倍、１０万倍通过，提高到稀释２０万倍，镅次能达到稀释５０万倍、１００万倍兔检通过。     

用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究

为用体外试验方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力,以猪瘟病毒抗体（兔源）为一抗、荧光素标记羊抗兔IgG 为二抗,建立了CSFV兔化弱毒株的间接免疫荧光检测方法（ IFA）。特异性试验表明,用该IFA方法检测CSFV兔化弱毒株接种的RK细胞为阳性,而检测伪狂犬病毒、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病毒接种的RK细胞均为阴性。 CSFV兔化弱毒株和活疫苗的兔体感染量（ RID）用兔体测定,半数组织感染量（ TCID50）用IFA测定,拟合RID与TCID50的线性回归方程,确定1RID/mL＝（ TCID50/0．1mL＋200）/12。     

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗的应用效果

应用猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗(下称猪瘟细胞苗)1500个免疫量免疫接种2月龄以上生猪。至育肥出栏时(10个月),随机取血清样检测。结果,中和抗体滴度均在16倍以上:间接血凝抗体滴度达16倍以上者为96.9%.这表明,其免疫抗体滴度均达到抵抗猪瘟强毒的水平。全县应用猪瘟细胞苗共免疫接种生猪112万头次(注射反应为0.07%),获得了显著的预防效果。母猪免疫接种8个月后所产53～58日龄仔猪,中和抗体滴度达到8倍者为50%,4倍者为43.75%;间接血凝抗体滴度16倍者为5.3%.8倍者为42.1%.4倍者占47.36%。这表明,用猪瘟细胞苗1500个免疫量对母猪一年免疫一次,其所产仔猪在53～58日龄时的母源抗体水平不能全部保护猪瘟病毒的侵袭。     

昆虫细胞-杆状病毒系统分泌表达的猪瘟病毒E2蛋白及其免疫原性研究

为研制新型、可用于区分野毒感染、助力猪瘟净化的亚单位疫苗,本研究参考了近年来国内猪瘟病毒(CSFV)流行株的E2基因序列,并根据昆虫细胞密码子偏嗜性对其进行优化、合成后,克隆至转移载体中,构建了重组质粒,随后转化至含有穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac,制备了重组杆粒并转染至SF9细胞,获得了表达E2基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光试验和western blot检测结果显示该杆状病毒感染昆虫细胞后可正确表达E2蛋白(Bac-E2)。将Bac-E2(50μg/头份)与猪瘟兔化弱毒疫苗[HCLV,7500半数兔体感染剂量(RID50)/头份]分别免疫猪瘟抗体阴性仔猪,3周后用相同的剂量加强免疫。首免后5周Bac-E2组猪CSFV中和抗体均不低于11 024,显著高于HCLV组(p0.01);首免后35 d,利用105.0MLD(最小致死剂量)的CSFV石门强毒经耳后颈部肌肉注射攻毒后,Bac-E2和HCLV组猪的保护率均为100%,阴性对照组猪全部发病、死亡;采用荧光定量PCR检测各组猪口腔和肛门拭子中CSFV的排毒情况,结果显示Bac-E2和HCLV组猪攻毒后0～16 d的咽拭子及肛拭子中均未检测到CSFV核酸。阴性对照组猪攻毒后第4 d至濒死前均可在其拭子中检出高拷贝CSFV核酸。本研究为Bac-E2蛋白作为猪瘟亚单位疫苗的候选抗原蛋白奠定了研究基础。     

中药复方病毒克对兔HCLV模型组织病毒含量影晌的研究

探讨抗病毒中药复方制剂的抗病毒作用机理,为提高临床疗效和扩大临床应用范围提供试验依据,本研究采用水萃取法制备抗病毒中药复方流浸膏制剂,以HCLV"C"株为模式病毒,GAPDH、ACTB为内参基因,以FQ-PCR作为检测方法,研究该中药复方制剂在对兔感染HCLV后脾脏、肠系膜淋巴结病毒增殖的变化情况。研究结果表明,高、中、低3个中药剂量组在连续5次给药后的24 h,即攻毒后的72、96、120、144 h,脾脏和肠系膜淋巴结中的HCLV含量低于对照组,脾脏中144 h病毒含量尤为明显(P<0.05),肠系膜淋巴结中72 h病毒含量尤为明显(P<0.05),说明该中药复方制剂在大剂量连续使用的情况下能明显抑制猪瘟兔化弱毒"C"株在淋巴结和脾脏中的增殖作用,并预示着这种抑制作用可能存在量效关系和时效关系。     

规模化集约化养猪场猪瘟免疫程序的研究

根据PPA-ELISA测定的猪瘟弱毒抗体OD值来决定的规模化集约化养猪场的猪瘟免疫程序为:使用猪瘟弱毒犊牛睾丸细胞苗免疫的母猪,其仔猪在20日龄进行首免,60日龄或断乳后进行二免,育肥猪直至出栏,不再免疫。种猪于配种前进行第三次免疫,以后每半年于断奶后配种前进行一次加强免疫。每次免疫接种剂量均是2头剂猪瘟弱毒犊牛睾丸细胞苗。